史雨晨，柳景華

血管鈣化大鼠模型腎臟β-Klotho及成纖維細胞生長因子受體1表達研究

史雨晨，柳景華

目的：觀察血管鈣化對大鼠腎功能的損傷情況，及其與腎臟組織局部β-Klotho[成纖維細胞生長因子21（FGF21）的輔助因子]、成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）表達變化關(guān)系，探討β-Klotho及FGFR1在血管鈣化腎臟損傷中的作用和意義。

方法：實驗動物按電腦隨機數(shù)字表法分為正常對照組和鈣化組，每組6只。鈣化組采用維生素D3聯(lián)合尼古丁誘導(dǎo)大鼠血管鈣化模型。以肌氨酸氧化酶法檢測大鼠血清肌酐濃度，以紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測大鼠血清尿素氮濃度，以生化法檢測大鼠血鈣及血磷濃度，以堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測大鼠腎臟組織ALP活性，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腎臟組織β-Klotho及FGFR1蛋白含量。

結(jié)果：與正常對照組比較，血管鈣化組大鼠血清肌酐及尿素氮水平升高[（35.200±4.087）μmol/L vs（26.000±5.0990）μmol/L，（P<0.05）； （6.900±0.623）mmol/L vs（5.400±0.803）mmol/L，（P<0.05）]；大鼠腎臟組織局部ALP活性升高[（60.510±31.090）U/g vs（26.590±8.664）U/g，（P<0.05）]；腎臟組織β-Klotho蛋白表達量增加[（9.052±1.238）ng/mg vs（6.860±1.036）ng/mg，（P<0.05）]，而血鈣及血磷濃度及大鼠腎臟組織FGFR1蛋白含量較正常對照組未見明顯變化。

結(jié)論：大劑量維生素D3肌肉注射聯(lián)合尼古丁灌胃可導(dǎo)致大鼠腎臟組織局部鈣超載及微血管鈣化形成，并導(dǎo)致腎功能不全，出現(xiàn)早期慢性腎臟病（CKD）臨床表現(xiàn)。同時病變腎臟組織局部β-Klotho表達量上調(diào)，而FGFR1在腎臟組織局部未見明顯變化，提示FGF21在血管鈣化大鼠腎臟組織局部的調(diào)節(jié)作用可能不是通過增加其受體FGFR1的數(shù)量，而是通過上調(diào)其結(jié)合輔助因子β-Klotho的表達而實現(xiàn)的。同時提示β-Klotho參與了血管鈣化腎臟損傷的早期調(diào)節(jié)過程，可能為預(yù)測機體鈣超載情況及CKD早期的預(yù)警信號，對CKD的早期診斷具有一定價值。

β-Klotho；受體,成纖維細胞生長因子；血管鈣化

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:507.)

血管鈣化是指血管壁鈣磷的過度沉積，其主要成分是羥磷灰石Ca5（PO4）3OH[1]。新近觀點認為，血管鈣化與生理性骨骼形成過程相類似，是在各種刺激因素介導(dǎo)下，鈣磷沉積于血管壁的一個可預(yù)防和可逆轉(zhuǎn)的高度可調(diào)控生物學(xué)過程[2]。

慢性腎臟病（CKD）是各種腎臟疾病的終末階段，臨床研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者血管鈣化率明顯高于正常同齡人[3]。同時，血管鈣化導(dǎo)致的高血壓、腎小球囊內(nèi)壓升高及腎臟微血管鈣化又將加速CKD的發(fā)生與發(fā)展[4]。

新近研究提示，成纖維細胞生長因子21（FGF21）在CKD中發(fā)揮一定作用[5]。本實驗室先期實驗已經(jīng)證明，F(xiàn)GF21與血管鈣化腎臟損傷存在一定關(guān)系。同時既往研究已經(jīng)證明，F(xiàn)GF21必須通過FGF21-成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）-β-Klotho三聚體方可發(fā)揮作用[6]。因此，本實驗旨在通過研究血管鈣化大鼠模型腎臟損傷過程中β-Klotho及FGFR1的變化情況，初步探究β-Klotho及FGFR1在血管鈣化腎臟損傷過程中的作用，并為進一步研究FGF21在血管鈣化腎臟損傷過程中的作用機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

材料:成年雄性SD大鼠[約8周齡，(190±10）g] 12只,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。β-Klotho ELISA試劑盒、FGFR1 ELISA試劑盒為Cloud-Clone Corp.公司（武漢優(yōu)爾生）產(chǎn)品。維生素D3、尼古丁為美國Sigma公司產(chǎn)品。堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒為南京建成生物公司產(chǎn)品。其余為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

鈣化動物模型建立及實驗分組:參照Niederhoffer等[7]方法建立血管鈣化動物模型：選用體重180～200 g雄性SD大鼠，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7天后以電腦隨機數(shù)字表法隨機分為兩組，每組6只，自由飲水飲食。血管鈣化組第1天9：00給予維生素D3（300 000 IU/kg）肌肉注射，尼古丁溶于花生油（25 mg/kg，5 ml/kg）灌胃；18：00尼古丁溶于花生油重復(fù)灌胃一次；第14天9：00重復(fù)給予維生素D3（300 000 IU/kg）肌肉注射一次。正常對照組給予等量生理鹽水溶液肌肉注射和單純花生油灌胃，方法同血管鈣化組。兩組動物常規(guī)飼養(yǎng)4周后予2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，4℃離心分離血清，-80℃儲存待測。摘取大鼠腎臟組織，冰生理鹽水溶液沖洗后，保存于-80℃待測。

總蛋白提取及測定:動物處死后迅速摘取待測組織，以每10 mg組織加入100 μl蛋白裂解緩沖液的比例在冰浴條件下剪碎組織，后應(yīng)用玻璃勻漿器勻漿。4℃條件下2 680 g離心15 min，取上清液行蛋白定量，加入原液1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸15 min后置于冰上，按BCA法測定蛋白濃度[8]。

腎臟組織堿性磷酸酶活性測定:取腎臟組織約50 mg，按ALP檢測試劑盒操作，并依據(jù)樣品中蛋白克數(shù)，計算單位蛋白中ALP活性[9]。

β-Klotho及FGFR1的酶聯(lián)免疫吸附法測定:取標(biāo)準(zhǔn)化濃度組織蛋白樣品按ELISA試劑盒說明書操作。

血清尿素氮濃度測定:動物麻醉后心臟取血，4℃ 1 000 g離心分離血清，采用紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測大鼠血清尿素氮水平[10]。

血清肌酐濃度測定:動物麻醉后心臟取血，4℃1 000 g離心分離血清，采用肌氨酸氧化酶法檢測大鼠血清肌酐水平[5]。

血鈣及血磷濃度測定:動物麻醉后心臟取血，4℃ 1000 g離心分離血清，血鈣及血磷水平檢測在日本東芝TBA-40FR全自動生化儀上完成。

統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料兩組間比較采用t檢驗分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠血清肌酐及尿素氮濃度測定 （圖1,圖2）：血管鈣化組大鼠血清肌酐及尿素氮濃度較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（35.200±4.087）μmol/L vs（26.000±5.099）μmol/L，（P<0.05）；（6.900±0.623）mmol/L vs（5.400±0.803）mmol/L，（P<0.01）]。

圖1 兩組大鼠血清肌酐濃度（n=5）

圖2 兩組大鼠血清尿素氮濃度（n=6）

兩組大鼠血鈣及血磷濃度測定:使用維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)后，血管鈣化組大鼠血鈣及血磷濃度較正常對照組未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（1.727±0.629）mmol/L vs（2.098±0.185）mmol/L，（P>0.05）；（1.708±0.165）mmol/L vs（1.690±0.160）mmol/L，（P>0.05）]

腎臟組織局部ALP活性測定(圖3):血管鈣化組大鼠腎臟組織局部ALP活性較正常對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（60.510±31.090）U/g vs（26.590±8.664）U/g，（P<0.05）]。

酶聯(lián)免疫吸附法檢測β-Klotho蛋白在腎臟組織表達情況(圖4):取大鼠腎臟組織勻漿進行蛋白定量后做酶聯(lián)免疫吸附檢測發(fā)現(xiàn)，血管鈣化組大鼠腎臟組織中β-Klotho蛋白含量較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（9.052±1.238）pg/mg vs（6.860±1.036）pg/mg，（P<0.05）]。

酶聯(lián)免疫吸附法檢測FGFR1蛋白在大鼠腎臟表達情況:血管鈣化組大鼠腎臟組織FGFR1蛋白含量較正常對照組未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（0.186±0.047）ng/mg vs（0.184±0.039）ng/mg，（P>0.05）]。

圖3 大鼠腎臟組織局部堿性磷酸酶活性（n=6）

圖4 酶聯(lián)免疫吸附法分析顯示血管鈣化組大鼠腎臟組織β-Klotho蛋白含量（n=5）

3 討論

血管鈣化作為一種全身性血管病變，可累及大、中、小各級動脈，引起系統(tǒng)動脈壓升高，從而導(dǎo)致腎小球動脈收縮、硬化及缺血性腎損害。腎動脈及其分支血管鈣化的形成又可進一步加速腎臟損害的進展[11]。同時，血管鈣化將導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生，腎臟組織的炎癥反應(yīng)及免疫復(fù)合物沉積將促進腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。已有臨床研究表明，血管鈣化與CKD患者的死亡率及心血管事件的發(fā)生率密切相關(guān)。因此，血管鈣化與CKD互為促進因素。研究血管鈣化與腎臟損傷的內(nèi)在聯(lián)系及相關(guān)機制，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測因子乃至研發(fā)其治療藥物，對防治血管鈣化及CKD具有重要意義。

我實驗室先前已經(jīng)證明，F(xiàn)GF21在血管鈣化大鼠腎臟組織局部表達量有所升高，并與腎臟鈣超載相關(guān)因子ALP具有一定相關(guān)性，提示FGF21可能在血管鈣化腎臟損傷中發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用，但其具體機制尚有待進一步研究[13]。既往研究顯示，β-Klotho及FGFR1作為FGF21的效應(yīng)受體，F(xiàn)GF21必須通過FGF21-FGFR1-β-Klotho三聚體方可發(fā)揮作用[14]?；诖宋覀冊O(shè)想，腎臟組織中β-Klotho及FGFR1對FGF21可能有一定調(diào)節(jié)作用，決定著FGF21的作用發(fā)揮。

本實驗結(jié)果顯示，大劑量維生素D3肌肉注射聯(lián)合尼古丁灌胃可導(dǎo)致大鼠腎臟組織局部ALP活性上調(diào)。ALP是細胞成骨樣變早期分化的重要標(biāo)志，為檢測早期組織鈣化的金標(biāo)準(zhǔn)之一[15]。故該結(jié)果說明，腎臟組織局部鈣超載形成，并導(dǎo)致大鼠腎臟功能改變，血肌酐及尿素氮水平較正常對照組升高，出現(xiàn)早期CKD臨床表現(xiàn)。從而提示，嚴(yán)重血管鈣化患者都可能存在一定程度的腎臟損傷。同時臨床研究證實，未經(jīng)治療的CKD患者血鈣磷水平一般要到CKD 4～5期方會發(fā)生變化[16]。本實驗?zāi)Ｐ椭形匆姶笫笱}磷水平發(fā)生變化，再次從側(cè)面驗證血管鈣化腎臟損傷模型為腎臟損傷早期模型。并且證明，維生素D3并不是通過改變機體血鈣磷水平從而導(dǎo)致血管鈣化的發(fā)生發(fā)展的[17]。相較于5/6腎臟切除模型等CKD大鼠模型，本模型造成的CKD程度較輕，相當(dāng)于人類CKD早期。我實驗室先前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21在血管鈣化腎臟損傷大鼠腎臟組織局部表達量有所升高，并與腎臟鈣超載相關(guān)因子ALP具有一定相關(guān)性。既往實驗已經(jīng)證明，β-Klotho及FGFR1作為FGF21的效應(yīng)受體，F(xiàn)GF21必須通過FGF21-FGFR1-β-Klotho三聚體方可發(fā)揮作用[6]。本實驗結(jié)果顯示，β-Klotho在腎臟鈣超載模型大鼠中升高，可能參與了對FGF21作用的輔助調(diào)節(jié)過程。同時FGFRs作為FGFs的特異性受體，其組織特異性決定了FGFs的作用特異性。因此我們也檢測了與FGF21親和力最強的FGFR1在大鼠腎臟組織中的變化情況[18]。然而實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR1在腎臟組織局部未見明顯變化。從而提示，F(xiàn)GF21在血管鈣化大鼠腎臟組織局部的調(diào)節(jié)作用可能不是通過增加其受體FGFR1的數(shù)量而是通過上調(diào)其結(jié)合輔助因子β-Klotho的表達而實現(xiàn)的。β-Klotho作為FGF21與FGFR1結(jié)合的輔助因子，其升高可以增加FGF21與其受體FGFR1結(jié)合的穩(wěn)定性，從而提高FGF21與FGFR1的結(jié)合能力，進而增加FGF21的生物效能。

FGF21-FGFR1-β-Klotho三聚體作為新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)分泌型成纖維生長因子，其作用途徑在各種代謝性疾病中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但其具體機制還有待進一步研究[19]。本研究報道了β-Klotho在血管鈣化腎臟損傷大鼠腎臟組織局部表達增加，而FGFR1表達則未見明顯變化，從而提示，β-Klotho可能在血管鈣化腎臟損傷早期即可發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用。為進一步深入研究FGF21-FGFR1-β-Klotho在血管鈣化腎臟損傷中的具體機制提供了一定基礎(chǔ)。同時提示腎臟組織β-Klotho表達水平可能為預(yù)測機體鈣超載情況及CKD早期的預(yù)警信號，對CKD的早期診斷具有一定提示作用。

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Expressions of Kidney β-Klotho and Fibroblast Growth Factor Receptor 1 in Experimental Rats Model With Vascular Calcification

SHI Yu-chen, LIU Jing-hua.

28thWard, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing (100029), China

LIU Jing-hua, Email: liujinghua@vip.sina.com

Objective: To observe the impact of vascular calcif i cation on kidney injury rats with the expressions of β-Klotho, fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) in kidney tissue in order to find the predictor for early chronic kidney disease (CKD), to provide the prevention and investigation basis of vascular calcif i cation and CKD.

Methods: Vascular calcif i cation model was induced by vitamin D3 and nicotine injection in experimental rats and the animals were divided into 2 groups: Normal control group and Calcif i cation group. n=6 in each group. Serum levels of creatinine and urea nitrogen were examined by sarcosine oxidase method and UV-glutamate dehydrogenase method respectively; blood levels of calcium and phosphorus were detected by biochemistry method; kidney tissue alkaline phosphatases (ALP) activity was measured by ALP detection kit, protein expressions of β-Klotho and FGFR1 were assessed by ELISA.

Results: Compared with Normal control group, Calcif i cation group showed increased serum levels of creatinine (35.200±4.087) umol/L vs (26.000±5.0990) umol/L and urea nitrogen (6.900±0.623) mmol/L vs (5.400±0.803) mmol/ L, both P<0.05; elevated kidney tissue ALP activity (60.510±31.090) U/g vs (26.590±8.664) U/g and β-Klotho protein expression (9.052±1.238) ng/mg vs (6.860±1.036) ng/mg, both P<0.05. Blood levels of calcium, phosphorus and kidney tissue FGFR1 protein content were similar between 2 groups.

Conclusion: Large dose vitamin D3 and nicotine injection may induce vascular calcification and early CKD symptom in experimental rats; β-Klotho protein expression was signif i cantly increased suggesting that β-Klotho had been involved in the early regulation of vascular calcif i cation and it could be used for the early diagnosis of CKD at certain point.

β-Klotho; Receptor, fi broblast growth factor; Vascular calcif i cation

2016-09-06)

(編輯:汪碧蓉)

國家自然科學(xué)基金(81570388)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）課題（2015CB554404）；北京市自然科學(xué)基金項目(7142048)

100029 北京市,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 北京市心肺血管疾病研究所 心內(nèi)科28病房

作者單位：史雨晨 住院醫(yī)師 碩士研究生 主要從事心血管內(nèi)科研究 Email：shiyuchen0111@163.com 通訊作者：柳景華 Email：liujinghua@vip.sina.com

R541

A

1000-3614（2017）05-0507-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.05.020