肖燕，宋方，吳強(qiáng)，黃晶

抑制干擾素誘導(dǎo)蛋白16表達(dá)減少人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞凋亡

肖燕，宋方*，吳強(qiáng)，黃晶

目的：研究干擾素誘導(dǎo)蛋白16（IFI16）表達(dá)抑制后對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（HAAFs）凋亡的影響。

方法：應(yīng)用IFI16基因小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染HAAFs使IFI16基因沉默（IFI16-siRNA組），以非特異性siRNA轉(zhuǎn)染作為其轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（Con-siRNA組），未經(jīng)處理的HAAFs作為未干預(yù)陰性對(duì)照組（Neg組）。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡, 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中IFI16 mRNA表達(dá)變化，蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)IFI16、抑癌因子（p53）、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21WAF（p21）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）及Bcl-2蛋白表達(dá)。

結(jié)果：IFI16-siRNA組與Con-siRNA組、Neg組相比，細(xì)胞凋亡率[（3.33±0.41）% vs （7.42±1.51）%、（6.49±1.10）%，P<0.05]與G0/G1期細(xì)胞比例[（56.64±4.77）% vs （69.67±3.54）%、（68.29±4.14）%，P<0.05]減少；而S期細(xì)胞比例[（25.23±5.19）% vs （13.76±2.07）%、（14.04±3.00）%，P<0.05]增加；伴隨著IFI16mRNA表達(dá)減少（P<0.05），以及IFI16-siRNA組IFI16、p53、p21、Bax蛋白表達(dá)量減少（P<0.05）；同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。

結(jié)論：抑制IFI16表達(dá)可減少HAAFs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，其機(jī)制部分與抑制p53/p21信號(hào)通路及調(diào)控Bax/Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

干擾素誘導(dǎo)蛋白16；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:511.)

隨著人們生活水平的不斷提高和社會(huì)老齡化程度的日趨加劇，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄及其介入治療術(shù)后再狹窄等心腦腎血管增殖性疾病的發(fā)病率、致死（殘）率逐漸增高，已成為目前占用較多社會(huì)衛(wèi)生資源的嚴(yán)重的健康和社會(huì)問(wèn)題[1]。血管外膜成纖維細(xì)胞（VAFs）作為構(gòu)成血管壁的重要成分，其生長(zhǎng)和凋亡失衡是血管增殖性疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[2,3]。人干擾素誘導(dǎo)蛋白16（IFI16）是干擾素誘導(dǎo)蛋白p200家族成員之一，具有抑制細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)IFI16在人腦血管外膜成纖維細(xì)胞（HBVAFs）存在豐富的表達(dá)，抑制IFI16表達(dá)能促進(jìn)HBVAFs的增殖及遷移[5]，但I(xiàn)FI16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（HAAFs）凋亡的影響尚少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究進(jìn)一步通過(guò)IFI16小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染使IFI16基因沉默從而抑制IFI16蛋白表達(dá)，觀察其對(duì)HAAFs凋亡及細(xì)胞周期的影響，探討其可能機(jī)制，為治療血管增殖、重構(gòu)性疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原代人主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞（HAAFs）、胎牛血清（2% fetal bovine serum）、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（fibroblast medium）及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（1% fibroblast growth supplement）均購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche中國(guó)（上海）公司；IFI16-siRNA（sc-35633）、陰性對(duì)照siRNA（sc-37007）、異硫氰酸熒光素（FITC）結(jié)合的陰性對(duì)照siRNA（sc-36869）及IFI16抗體（sc-8023）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；總RNA極速抽提試劑盒（220010）購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒（RR047A）、實(shí)時(shí)PCR熒光染料試劑盒（RR420A）購(gòu)自大連TakaRa公司；PCR擴(kuò)增引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，引物序列（IFI16：F 5'-AGGACCGTTCATGACCAGZATAG-3'，R 5'-TGCGTTCAGCACCATCACTTC-3'；GAPDH： F 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'）；抑癌因子（p53）抗體（10442-1-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21WAF（p21）抗體（ab92675）購(gòu)自英國(guó)Abcam上海分公司；B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（2870S）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（2772S）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）內(nèi)參抗體（sc-25778）及細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1052）購(gòu)自上海碧云天公司；膜聯(lián)蛋白V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I）（559763）購(gòu)自美國(guó)BD生物科學(xué)公司。

1.2 HAAFs的培養(yǎng)和分組

HAAFs的培養(yǎng)按Sciencell公司HAAFs細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明書(shū)的方法，取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，即IFI16特異性siRNA轉(zhuǎn)染使IFI16基因沉默組（IFI16-siRNA組）、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染作為其轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（Con-siRNA組），未經(jīng)處理的HAAFs作為未干預(yù)陰性對(duì)照組（Neg組）。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于六孔板中，1×105個(gè)/孔，用不含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。按X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作，添加siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物干預(yù)6 h后，換正常含雙抗的培養(yǎng)液48 h后收集細(xì)胞，使用熒光素共軛的陰性對(duì)照-siRNA檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在80%～90%之間。每組3 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR

提取各分組細(xì)胞總RNA后按TaKaRa公司定量RT-PCR試劑盒（RR047A）說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按TakaRa公司實(shí)時(shí) PCR熒光染料試劑盒（RR420A）說(shuō)明檢測(cè)各樣本mRNA的表達(dá)，PCR反應(yīng)條件為：起始模板預(yù)變性（95 ℃ 30 s），PCR循環(huán)模板變性（95℃ 5 s）+退火（60℃ 30 s）+延長(zhǎng)（72℃30 s）循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計(jì)算各組IFI16 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blotting）

提取細(xì)胞總蛋白，每孔上樣80 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，Western封閉液中室溫下封閉1 h；加入IFI16一抗工作液，室溫下孵育15 min后置4 ℃冰箱過(guò)夜；TBST緩沖液（pH=7.4）洗膜，室溫下孵育稀釋的二抗1 h；TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光。PVDF膜應(yīng)用Western一抗二抗去除液處理后，同法封閉、孵育p53、p21、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗及二抗。ImageJ軟件分析IFI16、p53、p21、Bcl-2及Bax與內(nèi)參條帶的吸光度值之比。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

按BD生物科學(xué)公司膜聯(lián)蛋白V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I）（559763）試劑盒說(shuō)明書(shū)操作收集、重懸及染色細(xì)胞后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死；按碧云天公司細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒（C1052）說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行細(xì)胞收集、染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期G0/G1及S期DNA含量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFI16-siRNA轉(zhuǎn)染效率

在6孔板中轉(zhuǎn)染FITC-結(jié)合的陰性對(duì)照siRNA 6 h后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染成功的HAAFs細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為80 %～90 %。與Neg組和Con-siRNA組比較，IFI16-siRNA組的IFI16 mRNA表達(dá)沉默效果明顯（0.31±0.10 vs 1.17±0.23、0.98±0.20，P<0.05）。

2.2 IFI16表達(dá)抑制對(duì)HAAFs凋亡和細(xì)胞周期的影響（表1）

與Neg組和Con-siRNA組比較，IFI16-siRNA組的細(xì)胞凋亡率減少（P<0.05），G0/G1期細(xì)胞減少及S期細(xì)胞增多（P<0.05），以上指標(biāo)在Neg組和ConsiRNA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 IFI16基因表達(dá)沉默對(duì)HAAFs凋亡和細(xì)胞周期的影響

表1 IFI16基因表達(dá)沉默對(duì)HAAFs凋亡和細(xì)胞周期的影響

注：IFI16：人干擾素誘導(dǎo)蛋白16；HAAFs：人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞；Neg組：未干預(yù)陰性對(duì)照組；IFI16-siRNA組：IFI16基因沉默組；Con-siRNA組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組。與Neg組和Con-siRNA組比較*P<0.05

?

2.3 抑制IFI16表達(dá)后p53/p21和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)變化

Western blotting結(jié)果顯示，與Neg組和ConsiRNA組比較，IFI16-siRNA組IFI16蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），p53、p21、Bax蛋白表達(dá)量減少（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量的增加（P<0.05）（圖1）。IFI16、p53、p21、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)在Neg組和ConsiRNA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 IFI16基因表達(dá)沉默對(duì)HAAFs中IFI16、p53/p21、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

血管重構(gòu)是血管增殖性疾病的主要病理生理機(jī)制，血管外膜的重構(gòu)是整個(gè)血管重構(gòu)的重要組成部分，VAFs是血管外膜的主要細(xì)胞，有效地抑制VAFs的增殖，促進(jìn)其凋亡對(duì)防治血管增殖性疾病有重要意義[2,3]。

IFI16通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子如p53等結(jié)合，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、衰老和凋亡[6，7]。我們前期的研究亦發(fā)現(xiàn)抑制IFI16表達(dá)能促進(jìn)HBVAFs的增殖及遷移[5]；且p200家族蛋白中與人IFI16高度同源的鼠p204過(guò)表達(dá)可抑制大鼠VAFs增殖與遷移[8]。在培養(yǎng)的人正常前列腺上皮細(xì)胞進(jìn)入衰老進(jìn)程時(shí)其IFI 16表達(dá)增加了4倍，而在前列腺腫瘤細(xì)胞PC-3中過(guò)表達(dá)IFI16會(huì)抑制克隆形成，出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象[9]。本研究結(jié)果表明，通過(guò)siRNA技術(shù)下調(diào)IFI16的表達(dá)，能減少HAAFs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。

p53是重要的腫瘤抑制基因，p21基因是p53基因最重要的下游基因之一，p21基因編碼的p21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，p53通過(guò)其抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡與衰老[10]。IFI16通過(guò)其200X結(jié)構(gòu)域中的保守模序MF/LHATVAT/S與p53蛋白直接結(jié)合，調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是其抑制細(xì)胞周期及增殖的主要機(jī)制之一[11]。同時(shí)Xin等[9]對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞PC-3（缺失功能性的p53蛋白）的研究表明IFI 16過(guò)表達(dá)能上調(diào)p21表達(dá)、抑制細(xì)胞周期，故以上作用不完全依賴于p53。本研究證實(shí)IFI16表達(dá)沉默后，p53及p21表達(dá)亦減少，提示IFI16促進(jìn)HAAFs細(xì)胞凋亡的作用至少部分與p53/p21信號(hào)通路有關(guān)。

Bcl-2蛋白家族在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，Bax和Bcl-2分別是Bcl-2家族中主要的促進(jìn)凋亡和抑制凋亡蛋白，細(xì)胞凋亡在很大程度上取決于細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白的比例[12]。本研究顯示，抑制IFI16的表達(dá)能下調(diào)Bax表達(dá)，同時(shí)Bcl-2的表達(dá)上調(diào)。因p53亦可以通過(guò)上調(diào)Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]，故IFI16是直接調(diào)控了Bcl-2/Bax信號(hào)通路亦或是通過(guò)p53來(lái)間接調(diào)控仍需進(jìn)一步通過(guò)沉默或失活p53來(lái)明確，但我們的研究至少提示IFI16參與了Bax及Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控。

綜上所述，通過(guò)特異性siRNA下調(diào)IFI16表達(dá)可抑制HAAFs細(xì)胞凋亡，其機(jī)制至少部分與抑制p53/p21信號(hào)通路及調(diào)控Bax/Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

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Inhibition of Interferon-inducible Protein 16 Expression Reduces the Apoptosis in Human Aortic Adventitial Fibroblasts

XIAO Yan, SONG Fang , WU Qiang, HUANG Jing.

Department of Cardiology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang (550002), Guizhou China

WU Qiang, E-mail: gzgywq@126.com

Objective: To study the impact of interferon-inducible protein 16 (IFI16) inhibition on apoptosis of human aortic adventitial fi broblasts (HAAFs).

Methods: Our research included 3 groups:①IFI16-siRNA group, specif i c small interference RNAs (siRNAs) of IFI16 were transfected into HAAFs in vitro to make IFI16 gene silence,②Con-siRNA group, non-specif i c siRNAs were transfected into HAAFs as negative control and③Untreated HAAFs group, blank control. HAAFs cell cycle and apoptosis rate were examined by f l ow cytometry, IFI16 mRNA expression was measured by real time qRT-PCR, protein expressions of IFI16, p53, p21, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot analysis.

Results: Compared with Con-siRNA group and Untreated HAAFs group, IFI16-siRNA group showed decreased apoptosis rate of HAAFs (3.33±0.41) % vs (7.42±1.51) % and (6.49±1.10) %, P<0.05, reduced ratio of G0/G1phase cells (56.64 ± 4.77 ) % vs (69.67±3.54) % and (68.29±4.14) %, P<0.05, while increased ratio of S phase cells (25.23±5.19) % vs (13.76±2.07) % and (14.04±3.00) %, P<0.05. Meanwhile, IFI16-siRNA group presented down-regulated IFI16 mRNA and protein expressions, decreased protein levels of p53, p21, Bax and increased protein level of Bcl-2, all P<0.05.

Conclusion: Inhibited IFI16 expression could decrease HAAFs apoptosis, promote cell cycle transition fromG1 to S phase which might be related to the suppression of p53/p21 signaling pathway and regulation of Bax/Bcl-2 expression.

Interferon-inducible protein; Adventitial fi broblast; Apoptosis

2016-07-01)

(編輯：汪碧蓉)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260030)；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字 [2015] 7159號(hào)）

550002 貴州省貴陽(yáng)市，貴州省人民醫(yī)院 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科

肖燕 住院醫(yī)師 碩士 主要研究方向?yàn)檠苤貥?gòu) Email：397694152@qq.com 通訊作者：吳強(qiáng) Email： gzgywq@126.com*為共同第一作者

R541

A

1000-3614（2017）05-0511-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.05.021