顧麗萍 楊貴麗 陳幼發(fā) 陶書(shū)超

(武漢科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，武漢430065)

Th22細(xì)胞及其功能分子IL-22在狼瘡性腎炎中的作用研究

顧麗萍 楊貴麗①陳幼發(fā)②陶書(shū)超③

(武漢科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，武漢430065)

目的：觀察狼瘡性腎炎(LN)患者外周血中的Th22細(xì)胞及其功能分子白細(xì)胞介素(IL)-22的表達(dá)，并探討其意義。方法：選擇系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(無(wú)腎臟受累)38例，狼瘡性腎炎患者32例，健康志愿者10例，分別作為SLE組、LN組和健康對(duì)照組(HC組)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其外周血中Th22細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者血清中IL-22的水平。比較三組Th22細(xì)胞和血清中IL-22水平差異，分析LN組Th22細(xì)胞和IL-22與SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(SLEDAI)的相關(guān)性。結(jié)果：SLE組和LN組患者外周血中Th22細(xì)胞較健康對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，血清中IL-22水平也較健康對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；Th22和IL-22在LN組較SLE組要稍微高表達(dá)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LN組患者Th22細(xì)胞比例和IL-22水平與對(duì)應(yīng)患者的疾病活動(dòng)性評(píng)分SLEDAI呈正相關(guān)。結(jié)論：Th22細(xì)胞和其功能分子IL-22參與SLE和LN的發(fā)病和進(jìn)展。

Th22細(xì)胞；IL-22；狼瘡性腎炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種自身免疫炎癥性疾病，多發(fā)于青年女性，其病因目前尚未完全確定，其臨床癥狀表現(xiàn)多樣，可侵襲機(jī)體多個(gè)器官組織，腎臟是 SLE 侵襲的主要器官之一，腎臟受累后多表現(xiàn)為腎炎，該疾病稱為狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)[1]。LN是SLE的主要并發(fā)癥和致死因素之一，發(fā)病期間，腎小球系膜細(xì)胞大量增生，眾多細(xì)胞因子在發(fā)病過(guò)程中參與并發(fā)揮了重要作用[2]。由于LN 發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有效評(píng)價(jià)LN 活動(dòng)性，并給予正確對(duì)應(yīng)的治療方法對(duì)于改善患者預(yù)后，提高患者生存率極為重要。目前，診斷LN 及判斷其活動(dòng)性的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)是腎穿刺活檢病理檢查，但由于其為有創(chuàng)方式，對(duì)患者存在或多或少的損害，或由于患者自身?xiàng)l件限制，不能進(jìn)行廣泛、反復(fù)應(yīng)用。因此，尋找能有效評(píng)判LN 活動(dòng)性的新型指標(biāo)尤為重要。Th22細(xì)胞是一類輔助性T細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或被感染時(shí)，能產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-22[3]，作用于組織細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期蛋白，輔助機(jī)體產(chǎn)生防御作用。IL-22屬于IL-10家族細(xì)胞因子，其受體包括IL-10R2和IL-22R1兩條鏈組成[4]，IL-22結(jié)合特異性由IL-22R1決定[4]。IL-22作為一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞因子，多作用于機(jī)體組織細(xì)胞[4]。因其在自身免疫性疾病與炎性疾病中發(fā)揮著重要作用，近年來(lái)愈加受到研究者的重視，針對(duì)Th22及其細(xì)胞因子IL-22在皮膚病(如銀屑病、異位性皮炎等)[5]、炎性腸道疾病(克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎等)[6,7]、感染[8]、腫瘤[9]等疾病中的作用已開(kāi)展相關(guān)性研究，而關(guān)于Th22細(xì)胞和IL-22在SLE 和LN 中的作用研究尚不多見(jiàn)。故本次研究通過(guò)檢測(cè)SLE患者外周血Th22和Th17細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17和IL-22的水平，并分析它們與疾病的關(guān)系，從明確Th22在狼瘡性腎炎中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2014年12月～2015年12月醫(yī)院腎臟內(nèi)科、風(fēng)濕科、皮膚科共 70例 SLE 住院患者血清，男18例，女52 例，年齡17～51歲?；颊咴\斷參照 2009年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的 關(guān)于SLE 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)選用2000年SLE活動(dòng)指數(shù)(SLE disease activity index,SLEDAI-2000)[11]。70 例患者中有 32 例經(jīng)腎活檢確診為L(zhǎng)N且每例腎組織切片中至少有8個(gè)腎小球，設(shè)為L(zhǎng)N組，其余38例患者設(shè)為SLE組。收集 10 例門診健康體檢者(各項(xiàng)生化指標(biāo)正常，自身抗體陰性，無(wú)腎臟疾病、皮膚病、糖尿病、高血壓、風(fēng)濕免疫等疾病)作為健康對(duì)照組(HC組)，其中男 2例，女 8例，年齡 20～ 45歲。所有患者及健康志愿者3個(gè)月內(nèi)無(wú)免疫試劑使用史，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)符合道德倫理委員會(huì)的要求，并均采集外周靜脈血以備實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人 IFNγ-FITC、鼠抗人IL-17-Alexa Fluor(美國(guó) BD 公司)；鼠抗人 CD4-PerCP(美國(guó) Becton Dickinson)；鼠抗人IL-22-PE(美國(guó) minneapolis)；人IL-22 ELISA 試劑盒(美國(guó) R&D 公司)；淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院生物工程研究所-灝洋生物)。

1.1.3 臨床資料收集 收集受試對(duì)象一般臨床資料，具體包括性別、年齡、發(fā)熱、皮疹、雷諾現(xiàn)象、關(guān)節(jié)疼痛等基本情況，SLEDAI 評(píng)分以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目包括：血常規(guī)、尿常規(guī)、抗雙鏈DNA 抗體(anti-double-stranded DNA，dsDNA)、抗 Sm 抗體、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、超敏 C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、血清補(bǔ)體 C3、C4、免疫球蛋白等。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采集SLE患者和健康志愿者2 ml肘靜脈血，用新鮮肝素鈉抗凝，1 500 r/min離心5 min去除血漿，吸取淋巴細(xì)胞分離液4 ml 放入10 ml 離心管中，1 700 r/min離心30 min后，吸取中間白膜層(即單核細(xì)和淋巴細(xì)胞富集層)，放入恒溫箱繼續(xù)孵育 4 h。然后加入熒光標(biāo)記的表面抗體 anti-CD4-PerCP 4 μl，避光孵育30 min后去上清液，再向兩試管中分別加入破膜劑 B 50 μl，熒光標(biāo)記的抗體：anti-IFNγ-FITC、anti-IL-22-PE、anti-IL-17-Alexa Fluor 各 1 μl，24 h內(nèi)使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Th22細(xì)胞的標(biāo)記為IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+，Th1細(xì)胞標(biāo)記為 IFN+CD4+。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用 ELISA(酶聯(lián)吸附法)檢測(cè)各組患者血清IL-22的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組樣本的基本信息 HC組、SLE患者和LN患者的一般信息和臨床特點(diǎn)見(jiàn)表1。3組患者年齡、性別比較差異不明顯(P>0.05)，SLE組和LN組CRP、ESR、WBC顯著高于HC組，而C3、C4顯著低于HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而SLE組和LN組兩組間上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組患者Th1和Th22細(xì)胞測(cè)定結(jié)果 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LN組、SLE組和健康對(duì)照組患者外周血Th1和Th22細(xì)胞的流式計(jì)數(shù)。SLE患者、LN患者以及健康對(duì)照組代表性流式圖及設(shè)門見(jiàn)圖1A。結(jié)果表明SLE組、LN組和健康對(duì)照組患者Th1細(xì)胞表達(dá)頻率分別為(SLE：10.07±0.27，LN：10.86±0.27，HC：10.13±0.45)，3組之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Th22在LN組較SLE組要稍微高表達(dá)(6.92±0.47 vs 5.87±0.36，P=0.056)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組患者Th22的表達(dá)頻率均較健康對(duì)照組(2.69±0.23)要高表達(dá)，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖1B。

表1 各組患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室基本信息

Tab.1 Clinical and laboratory characteristics of subjects

ClinicalandlaboratorycharacteristicsHC(n=10)SLE(n=38)LN(n=32)Sex(M/F)2/87/3111/21Years(y)33.24±13.6735.67±10.2337.23±8.34SLEDAI(score)ND28±6.5133±10.24Anti-dsDNAnegative(n)ND3432Anti-Smnegative(n)ND1013ANAnegative(n)ND3028CRP(mg/L)7.2±3.4045.67±25.861)48.24±30.781)ESR(mm/h)2±1.8056±381)63±321)C3(U/ml)0.9±0.340.32±0.351)0.25±0.311)C4(U/ml)0.31±0.210.08±0.071)0.09±0.041)Whitebloodcell(×109L-1)4.24±2.317.28±3.651)8.56±4.311)

Note：Compared with HC group,1)P<0.05.

圖1 Th1和Th22細(xì)胞在SLE、LN和健康對(duì)照組外周血中的表達(dá)Fig.1 Frequencies of peripheral blood Th1 and Th22 cells in patients with SLE，LN and healthy controls

圖2 各組患者血清IL-22的表達(dá)Fig.2 Plasma level of IL-22 in patients with LN，SLE and healthy controls

2.3 各組患者血清IL-22水平 ELISA測(cè)定3組患者血清IL-22的表達(dá)，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，LN組患者血清IL-22較SLE組升高，差異沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(59.92±2.69 vs 52.51±2.45，P=0.05)；LN組和SLE組患者血清IL-22水平均較HC組(40.43±2.98)明顯升高，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Th22細(xì)胞與IL-22相關(guān)性分析 將LN患者Th22細(xì)胞表達(dá)頻率與血清IL-22的水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LN患者Th22細(xì)胞比例與血清IL-22水平呈正相關(guān)(r=0.80，P<0.001)，見(jiàn)圖3。

圖3 Th22細(xì)胞與血清IL-22水平相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between Th22 cells and plasma IL-22 level in patients with LN

圖4 Th22細(xì)胞比例和血清IL-22水平與患者SLEDAI評(píng)分相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between Th22 or plasma IL-22 level and SELDAI in patients with LN

2.5 Th22細(xì)胞和IL-22與SLEDAI評(píng)分相關(guān)性分析 我們進(jìn)一步對(duì)LN患者Th22細(xì)胞比例和IL-22血清水平與患者對(duì)應(yīng)的SLEDAI評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明Th22細(xì)胞比例與IL-22血清水平和SLEDAI評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.34、0.45，P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 討論

SLE是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，身體的各個(gè)部位均可受損害，腎臟作為自身免疫性疾病的靶向器官，由于血管豐富，在血管壁上引起炎性反應(yīng)，使腎臟成為SLE最易受累的臟器，形成LN[12]。目前，臨床上LN的治療主要采用給予激素和免疫抑制劑的方式，但只能使病情得到一定的緩解，而且有較大的毒副作用。因此，明確LN的發(fā)病機(jī)制，借此尋求有效治療措施有著重要的社會(huì)意義。

LN是由多種免疫復(fù)合物沉積和激活而引發(fā)的一種腎炎。之前很多研究發(fā)現(xiàn),LN患者機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)主要是由機(jī)體炎癥因子和免疫因子共同激活引起的[13,14]。另外之前的研究發(fā)現(xiàn)，由于疾病導(dǎo)致機(jī)體免疫炎癥紊亂，Th 細(xì)胞及其分泌的相應(yīng)功能性因子激活進(jìn)一步引起反應(yīng)性 B 細(xì)胞活化，致病性自身抗體和炎癥因子大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致患者組織和器官的損傷[15]。Th22細(xì)胞是學(xué)者們最近新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立Th 細(xì)胞亞群，能夠分泌功能性細(xì)胞因子IL-22[16]。Th22細(xì)胞在自身免疫病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)Th22細(xì)胞激活后分泌大量的IL-22實(shí)現(xiàn)[17,18]。IL-22作用靶器官主要為患者皮膚和腎臟等，例如在銀屑病中，IL-22介導(dǎo)了患者的皮膚病病灶組織中的免疫細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞等上皮細(xì)胞間的相互作用[19]。根據(jù)以上理論基礎(chǔ)，本課題比較了SLE、LN患者與健康對(duì)照之間Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22表達(dá)水平的差異；分析了LN 患者Th22與相關(guān)細(xì)胞因子、疾病活動(dòng)性和患者臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。

我們的研究發(fā)現(xiàn)SLE患者和LN患者外周血中Th22細(xì)胞的表達(dá)頻率均明顯高于健康對(duì)照組。另外我們發(fā)現(xiàn)LN患者外周血中Th22細(xì)胞的比例較SLE患者要有所增高，目前的樣本分析差異沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而這也提示我們Th22細(xì)胞的表達(dá)頻率與SLE患者疾病的進(jìn)展和活動(dòng)度有一定的關(guān)系。進(jìn)一步我們分析LN患者Th22細(xì)胞比例與對(duì)應(yīng)患者的疾病活動(dòng)性評(píng)分SLEDAI之間呈正相關(guān)。同時(shí)我們檢測(cè)其功能分子IL-22，發(fā)現(xiàn)SLE、LN患者血清中IL-22的水平較健康對(duì)照組明顯升高，相應(yīng)的IL-22的血清水平在LN患者中較SLE患者要高。我們分析LN患者IL-22的水平與SLEDAI的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IL-22的血清水平與SELDAI呈正相關(guān)。這些結(jié)果與Qin等[20]的研究一致。且這些研究告訴我們Th22細(xì)胞及其功能分子IL-22參與了SLE和LN疾病的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制。

綜上所述，本次研究初步分析了Th22細(xì)胞與IL-22在LN患者中的表達(dá)，并且進(jìn)一步分析了Th22和IL-22與LN患者臨床疾病活動(dòng)度SEDAI的關(guān)系，我們的研究為L(zhǎng)N的發(fā)病機(jī)制提供了一些免疫方向的思索。接下來(lái)我們會(huì)進(jìn)一步研究是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Th22細(xì)胞和IL-22改變 LN患者發(fā)病時(shí)以及疾病加重時(shí)異常的免疫狀態(tài)，為 SLE或者LN 的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

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[收稿2016-10-26]

(編輯 倪 鵬)

Study on role of Th22 cells and its functional cytokine IL-22 in lupus nephritis

GULi-Ping,YANGGui-Li,CHENYou-Fa,TAOShu-Chao.

DepartmentofInternalMedicine,HospitalofWuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China

Objective:To observe the expressions of Th22 cells and IL-22 in peripheral blood of patients with Lupus nephritis (LN) and explore its significance.Methods: Patients of systemic lupus erythematosus (SLE) with no renal involvement (n=38),lupus nephritis (n=32) and healthy controls (n=10) were studied.Flow cytometry was utilized to quantify the percentage of Th22 cells in peripheral blood.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of serum IL-22.The Th22 cells and The serum level of IL-22 among three groups were compared,and the correlation between Th22,IL-22 and SLE disease activity index score (SLEDAI) was analyzed.Results: Th22 cells in SLE group and LN group were significantly higher than those in healthy control group (P<0.01).Serum IL-22 level was also significantly higher than that of healthy control group (P<0.01);Th22 and IL-22 LN group were slightly higher than that in SLE group,but the difference was not significant (P>0.05).The proportion of Th22 cells and the level of IL-22 in LN group were positively correlated with the disease activity score SLEDAI.Conclusion: Th22 cells and IL-22 may play an important role in the pathogenesis of SLE and LN.

Th22 cells;IL-22;Lupus nephritis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.025

顧麗萍(1966年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科疾病的診治工作，E-mail：guliping487@163.com。

R593.24+2

A

1000-484X(2017)05-0755-04

①通訊作者，E-mail：ygl473@163.com。

②武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院腎病科，武漢430070。

③棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，棗陽(yáng)441200。