肖 芳 鄭成云 蔣衛(wèi)東 綜述 陳 麗 審校

(山東大學(xué)第二醫(yī)院干部保健科,濟南250033)

NETs在自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用研究進展①

肖 芳 鄭成云②蔣衛(wèi)東 綜述 陳 麗③審校

(山東大學(xué)第二醫(yī)院干部保健科,濟南250033)

中性粒細胞作為人體固有免疫系統(tǒng)的哨兵，在血液的非特異性細胞免疫系統(tǒng)中起著十分重要的作用，它們由骨髓分化發(fā)育成熟后，進入血液或組織，當(dāng)微生物病原體特別是化膿性細菌入侵、炎癥發(fā)生時，在多種炎癥和細胞因子的介導(dǎo)下，它們便會被迅速招募并趨化至炎癥部位，通過分泌細胞因子、脫顆粒和吞噬作用等殺滅并清除病原體。在2004年，Zychlinsky等研究發(fā)現(xiàn)12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)可誘導(dǎo)中性粒細胞活化并釋放出包裹著組蛋白、彈性蛋白酶等多種胞內(nèi)物質(zhì)的網(wǎng)狀DNA纖維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有包裹、限制及殺傷病原菌的作用。這一中性粒細胞釋放的防御反應(yīng)性網(wǎng)狀DNA纖維結(jié)構(gòu)被命名為NETs[1,2]。隨著NETs在病原微生物所致的感染炎癥性疾病的抗病作用機制逐漸闡明的同時，NETs釋放引起胞內(nèi)成分外露、清除缺陷及隨后反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)失衡在諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脈管炎等多種自身免疫性疾病病程中的致病作用也不斷被人們揭示。目前對NETs導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)病和進展的具體機制仍不明確，本文就NETs特點及其產(chǎn)生機制和NETs在自身免疫疾病發(fā)病機制中的作用方面的研究進展進行綜述。

1 NETs的產(chǎn)生及分子機制

中性粒細胞形成NETs的過程稱為NETosis，這是一種有別于細胞壞死和凋亡的特殊細胞死亡過程[3]，可以被多種有機和或無機因素始動，如脂多糖(LPS)、PMA、免疫復(fù)合物、一氧化氮、過氧化氫等[4,5]?；罨蟮闹行粤＜毎诩毎螒B(tài)學(xué)上首先表現(xiàn)為核染色質(zhì)解聚，其后常染色質(zhì)和異染色質(zhì)變得難以區(qū)分，同時，細胞核分葉的特征也逐漸消失；在這一過程中，中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)從胞漿內(nèi)的嗜天青顆粒釋放出來并被轉(zhuǎn)運至細胞核，附著并降解組蛋白；隨后，顆粒蛋白膜及核膜逐漸趨于崩解，髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)便通過疏松的核膜進入細胞核與解聚的染色質(zhì)混合并繼續(xù)降解核染色質(zhì)；最后細胞膜崩解破裂，使包裹著組蛋白、MPO、NE等多種胞內(nèi)蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀染色質(zhì)纖維釋放至細胞外基質(zhì)[6,7](圖1為LPS誘導(dǎo)人中性粒細胞活化釋放NETs的實驗結(jié)果，網(wǎng)狀綠色熒光結(jié)構(gòu)為NETs)。

研究表明，NETosis的分子機制可能有以下幾個方面：活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)打亂了NE和蛋白多糖矩陣的聯(lián)系，而后者在細胞靜息狀態(tài)下可以下調(diào)蛋白酶活性，從而導(dǎo)致了NE及后續(xù)MPO從顆粒蛋白內(nèi)釋放，ROS還可以促使脂質(zhì)過氧化，在離子而非大分子誘導(dǎo)劑存在下使膜通透性增加[8]；NADPH氧化酶及其后續(xù)raf-MEK-ERK通路的活化也與NETosis發(fā)生有關(guān)[9]；另外，Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的瓜氨酸脫亞氨化修飾是NETosis發(fā)生的另一可能機制，通過阻斷這一修飾過程的關(guān)鍵酶PAD4可以阻止NETs產(chǎn)生。大量證據(jù)表明組蛋白的瓜氨酸化為自身抗原的主要來源，阻斷PAD4可以遏制小鼠關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等小鼠模型病程的發(fā)展[11,12]。新近有研究直接證實PAD4阻斷劑Cl-amidine抑制自發(fā)狼瘡小鼠模型發(fā)生NETosis，從而減少了自身抗體產(chǎn)生，降低了抗原抗體免疫復(fù)合物在模型鼠腎臟的沉積，改善內(nèi)皮細胞功能及削弱疾病活動[13]。因此，NETosis涉及多因素、多環(huán)節(jié)的共同參與，其具體機制人們目前了解甚少。

圖1 體外LPS誘導(dǎo)健康人中性粒細胞NETs形成Fig.1 LPS can elicit NETs release from healthy human neutrophils in vitro system

2 NETosis成為自身抗原的潛在來源

隨著NETs及NETosis過程的不斷闡明，人們對中性粒細胞參與免疫反應(yīng)的機制有了新的認識。Brinkmann等[14]研究結(jié)果已表明在暴露于細菌、LPS、PMA等環(huán)境下中性粒細胞可以發(fā)生NETosis，這一過程導(dǎo)致中性粒細胞胞內(nèi)成分外露，包括核染色質(zhì)和胞內(nèi)多種蛋白成分。通過電鏡可以觀察到細菌被包裹在含有DNA和組蛋白的NETs網(wǎng)狀纖維中，這種現(xiàn)象很容易讓人們聯(lián)想到狼瘡免疫復(fù)合物中的自身抗原與細菌佐劑對自身免疫反應(yīng)的激活作用。如果機體對NETs中自身抗原不能建立穩(wěn)固的免疫耐受，則針對于NETs內(nèi)含有的核染色質(zhì)和其他蛋白成分的自身抗體就會相繼出現(xiàn)。

值得注意的是，在NETosis發(fā)生過程NETs中的自身抗原已經(jīng)在多種酶和ROS作用下進行了修飾變型。組蛋白去亞氨化發(fā)生于NE、MPO等蛋白酶裂解組蛋白的過程中，大大降低了DNA和組蛋白的相互作用使得原本緊密的核染色質(zhì)變得疏松[10]。另外，酪氨酸和色氨酸殘基被氧化也改變了多種核內(nèi)自身抗原的功能[15]。對這些蛋白的修飾能夠產(chǎn)生很多潛在的自身抗原表位，如果免疫耐受沒能相應(yīng)形成就可能引發(fā)自身免疫反應(yīng)。

3 NETs在自身免疫疾病中的作用

自身免疫性疾病是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。研究表明，NETosis發(fā)生導(dǎo)致的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)暴露已成為機體自身抗原的主要來源，而與B細胞相互作用誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生在自身免疫疾病易感性的個體中發(fā)揮著重要致病或誘導(dǎo)疾病發(fā)生的作用。

3.1 NETs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，患者體內(nèi)有針對DNA、核染色質(zhì)、DNA聯(lián)合蛋白及包括NETs成分在內(nèi)的大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物，能夠造成多種組織損傷。狼瘡免疫復(fù)合物中的自身DNA含有多肽抗菌素LL-37，能夠激活漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoiddendriticcell，pDC)表面的Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)，促使IFN-α合成并保護核酸不被核酸酶降解。在SLE患者，這些DNA-抗菌復(fù)合物釋放出胞外的NETosis過程顯著加強，從而介導(dǎo)機體自身抗體的大量產(chǎn)生[16,17]。多年來，DNA-抗DNA抗體免疫復(fù)合物被認為是導(dǎo)致狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)腎臟損害的主要免疫復(fù)合物之一，電鏡和免疫熒光可以觀察到LN腎臟內(nèi)皮下和上皮下存在大量染色質(zhì)、抗DNA的IgG抗體、補體組成的免疫復(fù)合物。針對自身核成分的自身抗體的產(chǎn)生機制及免疫復(fù)合物中核染色質(zhì)的來源仍不明確，而NETs顯然成為了導(dǎo)致狼瘡腎臟、皮膚損害和其他自身免疫性疾病靶器官損害的免疫復(fù)合物中自身抗原的源頭[18]。近來研究表明，活化的中性粒細胞可能為循環(huán)和原位免疫復(fù)合物中核染色質(zhì)的重要來源。狼瘡患者血清中的免疫復(fù)合物包含中性粒細胞抗菌蛋白LL-37、MPO、蛋白酶-3(PR-3)及自身DNA[17]，與NETs中含有的成分高度相似，而對狼瘡患者和小鼠動物模型腎臟活檢的結(jié)果已驗證了NETs存在[18,19]。關(guān)于免疫復(fù)合物中NETs是如何沉積于腎小球局部及免疫復(fù)合物是如何形成仍需要進一步研究，而這對闡明狼瘡腎臟損害機制至關(guān)重要。

3.2 NETs與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性的，表現(xiàn)為外周關(guān)節(jié)非特異性炎癥的自身免疫性疾病?；疾￡P(guān)節(jié)及其周圍組織呈現(xiàn)進行性破壞，滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘疾。目前RA的病因仍不清楚，但已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明RA的發(fā)生與抗瓜氨酸肽抗體(Anti-citrullinated protein antibodies，ACPAs)有關(guān)，其中抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)已成為目前診斷RA的重要指標之一。ACPAs存在于超過2/3的RA病人血清中，并且比類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factors，RF)更具特異性[20]。Khandpur等[21]發(fā)現(xiàn)在RA患者循環(huán)和關(guān)節(jié)滑液的中性粒細胞比健康對照更容易發(fā)生NETosis，并且NETosis與ACPAs及系統(tǒng)炎癥指標的存在及水平相關(guān)，這可能與IL-17α和TNF-α對NETs的激活作用有關(guān)，同時瓜氨酸化的波形蛋白及α-烯醇化酶均能在RA患者來源的NETs中檢出，其形成的自身抗體又能反過來誘導(dǎo)NETs生成，而NETs大量生成后又可以促進成纖維細胞IL-8的產(chǎn)生。另有研究表明，瓜氨酸化H4組蛋白抗體能夠在約64% RA患者血清中檢測到并與抗CCP滴度相關(guān)，同時瓜氨酸化H4組蛋白在NETs存在并成為RA患者血清自身抗體的靶抗原，建立了NETs作為攜載自身抗原的形式參與RA疾病發(fā)病的可能相關(guān)關(guān)系[22]。因此，NETs可以作為自身抗原的來源，由此形成的自身抗體ACPAs又能反過來誘導(dǎo)NETs形成并繼發(fā)后續(xù)炎癥反應(yīng)。

3.3 NETs與ANCA相關(guān)性小血管炎 ANCA相關(guān)性小血管炎(Small-vessel vasculitis，SVV)也是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)閴乃佬孕⊙苎装Y。ANCA的靶抗原存在于白細胞胞漿中，中性粒細胞的主要顆粒和單核細胞溶酶體含有兩種主要靶抗原：MPO和PR-3。由于在NETs也大量存在這兩種蛋白，因此推測ANCA相關(guān)性血管炎可能與NETosis發(fā)生有關(guān)。Kessenbrock等[23]報道了SVV患者血清來源的IgG在體外比對照組血清IgG更容易誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生，并且這些抗體以NETs含有的MPO和PR3蛋白為靶抗原，而循環(huán)中MPO-DNA免疫復(fù)合物能夠在患者特別是處于疾病活動期的病人血清中檢測出，后對患者腎臟進行針刺活檢證實了NETs在病損的腎小球和基質(zhì)間的沉積，上述證據(jù)均表明NETs形成能夠引起血管炎及促進針對NET內(nèi)成分的自身免疫反應(yīng)。另外，SVV患者罹患靜脈血栓事件風(fēng)險很高，而NETs很可能成為聯(lián)結(jié)血小板和血液促凝成分的載體促進血栓形成。近來有研究發(fā)現(xiàn)SVV患者中性粒細胞能夠釋放NETs和含有組織因子(TF)的微囊泡，NETosis在處于活動期的患者更加顯著，而來源于患者和活動期病人血清樣本及從這些病例獲得的IgG能夠誘導(dǎo)表達TF的NETs和微囊泡大大生成[24]。尸檢顯示在SVV肺泡出血的患者中伴有中性粒細胞浸潤和嚴重新月體型腎小球腎炎，NETs不僅大量出現(xiàn)在腎臟組織，也存在于血栓中。在顯微鏡下多血管炎(MPV)患者血栓NETs檢出率要比MPV無關(guān)的血栓高的多[25]。正因為NETs攜載的MPO、PR-3自身抗原為ANCAs靶抗原，結(jié)合多項研究可以看出NETosis在自身免疫小血管炎的發(fā)病機制中起了關(guān)鍵作用，而由此可以推測NETosis和ANCAs的調(diào)節(jié)系統(tǒng)異?？赡艽嬖谥鴲盒匝h(huán)。

3.4 NETs與Felty綜合征 Felty綜合征是指除有典型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)外，還伴有脾臟腫大和白細胞計數(shù)減少的一種嚴重型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，該病患者血清中能夠檢測到針對組蛋白脫亞氨化修飾的自身抗體，并能夠誘導(dǎo)NETosis發(fā)生[26]，提示NETs可能在該疾病病程中發(fā)揮一定作用，但具體機制尚不清楚。

4 總結(jié)

自身免疫性疾病是一類發(fā)病機制復(fù)雜、病程遷延難愈的疾病，對于自身免疫領(lǐng)域的研究從未間斷，而新近NETs的發(fā)現(xiàn)可以被視為自身免疫異常發(fā)生機制的重大突破。自NETs被發(fā)現(xiàn)后，其生物學(xué)意義就一直都是研究的熱點。NETs可能是通過釋放自身抗原，與B細胞相互作用等誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生，參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前關(guān)于NETs的致病作用主要集中在SLE、RA等系統(tǒng)性自身免疫性疾病中，對于器官特異性自身免疫性疾病如橋本氏甲狀腺炎、1型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎等發(fā)生和進展是否也有NETs參與有待進一步探索，為進一步揭示自身免疫性疾病的發(fā)病機制、尋找預(yù)防和精準治療該類疾病奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2016-05-27 修回2016-06-12]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.032

①本文受山東省自然科學(xué)基金(ZR2016HP19)和山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF118033)資助。

肖 芳(1985年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫甲狀腺疾病的基礎(chǔ)及臨床研究,E-mail:xiaofangqshdd@163.com。

及指導(dǎo)教師：陳 麗(1957年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)與臨床研究,E-mail:chenli3@medmail.com.cn。

R392.1

A

1000-484X(2017)05-0781-04

②山東大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，濟南250033。

③山東大學(xué)齊魯醫(yī)院內(nèi)分泌科,濟南250012。