靳家揚 敬兆飛 王 晶 魏 林

(河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊050017)

類泛素化修飾Neddylation對免疫細胞的調(diào)控作用①

靳家揚 敬兆飛②王 晶③魏 林

(河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊050017)

NEDD8(Neural precursor cell-expressed develop-mentally downregulated 8)是由81個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，它和泛素蛋白(Ubiquitin)具有60%的一致性和80%的相似性[1]。NEDD8分子在真核生物中具有十分重要的生物學(xué)功能，其序列在真核生物中高度保守[2]。

Neddylation修飾需要的酶包括E1激活酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶和去NEDD化酶等[3]。已發(fā)現(xiàn)參與的E1激活酶是由APPBP1(Amyloid precursor protein-binding protein 1)和UBA3 (Ubiquitin-like modifier activating enzyme 3)組成的異源二聚體[4]；E2結(jié)合酶有UBC12和UBE2F[5];E3連接酶包括Rbx1、Dcn1、Mdm2、SCFFBXO11、c-Cbl等[6]。與泛素有許多底物不同的是，已發(fā)現(xiàn)的NEDD8的內(nèi)源性蛋白底物非常有限[7-9]。Neddylation系統(tǒng)最具有特征性的底物是Cullins。Cullins是Cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合物的必要組成部分，對于蛋白降解起關(guān)鍵的作用[10]。其他底物包括NUB1、NUB1L、RNF168、DNMT3B、JunB等；這些分子的功能也在不斷地被發(fā)現(xiàn)，例如NUB1和NUB1L與NEDD8相互作用，可引起26S蛋白酶體的降解，而RNF168則與DNA損傷有關(guān)，但仍有已發(fā)現(xiàn)的底物分子功能不清楚，需要進一步探究[9,11]。有報道稱,小分子MLN4924作為Neddylation抑制劑可以作為一種治療惡性腫瘤的方法，其作用機制為競爭性與ATP同E1酶結(jié)合，使其失去活性，從而阻止NEDD8的激活，抑制Neddylation的過程[12]。Neddylation對其底物蛋白的定位、穩(wěn)定性和功能均具有調(diào)節(jié)作用[13]。

1 NEDD8和Neddylation

NEDD8是類泛素化蛋白家族的成員，通過一系列與泛素類似的酶促反應(yīng)，和底物蛋白的賴氨酸殘基共價結(jié)合，這個過程稱為Neddylation[7]。

1.1 NEDD8成熟 NEDD8在酵母或者其他植物中被稱為RUB1(和泛素相關(guān))[14]。NEDD8的成熟需要其C 端剪切掉5個氨基酸，暴露76位甘氨酸，與底物上的賴氨酸形成異構(gòu)體;這種水解作用是由NEDD8特異性蛋白酶1(NEDD8-specific protease 1,NEDP1 )和UCH-LC3催化的， NEDP1也被稱為DEN1 或者SENP8[15]。NEDP1是NEDD8特異性蛋白酶，UCH-L3也是加工泛素前體的酶。UCH-L3敲低的小鼠是可以存活的，類泛素化的蛋白在沒有UCH-L3的細胞內(nèi)可以積累[16]，這說明在體內(nèi)UCH-LC3對于NEDD8加工不是必要的。

1.2 Neddylation修飾 與泛素化類似，成熟的NEDD8與目標(biāo)蛋白的結(jié)合需要E1-E2-E3多酶系統(tǒng)的激活。Neddylation第一步是成熟的NEDD8被E1 即NEDD8激活酶(NEDD8 activating enzyme，NAE)激活，NAE是由APPBP1和UBA3形成的二聚體組成，在ATP的作用下，NAE與NEDD8形成硫酯鍵[17]。第二步為激活的NEDD8轉(zhuǎn)移到E2 即NEDD8結(jié)合酶UBC12上，與其形成另一個硫酯鍵[17]。E3即NEDD8連接酶短暫的與帶有NEDD8的E2相互作用，然后通過在NEDD8 C端甘氨酸與底物賴氨酸殘基形成異構(gòu)肽將NEDD8轉(zhuǎn)移到底物上。然后E3將E2釋放掉，接受下一個帶有NEDD8的E2，進行下一個循環(huán)(圖1)。

NAE是Neddylation唯一的E1。小分子物質(zhì)MLN4924可以特異性的抑制NAE，阻止NAE與NEDD8結(jié)合，因此，可以特異并有效的抑制Neddylation的激活[18]。除了NAE，泛素E1激活酶UBE1也可以作為非典型的E1,調(diào)節(jié)NEDD8與泛素鏈的結(jié)合[19]。到目前為止，只有兩個E2被發(fā)現(xiàn)，UBC12和UBE2F。在體內(nèi)，UBC12和UBE2F表現(xiàn)為兩種Cullin Nedddylation的不同類型：UBC12激活Cullins 1-4，而UBE2F激活CUL5[5,20]。E3連接酶有很多種，在酵母，DCN1(defective in cullin neddylation 1 protein)是其E3連接酶，作為底物和Neddylation E2 UBC12相互作用的平臺[21]。在哺乳動物，有5種DCN1類似的蛋白(DCNL)作為其E3，其中DCNL1促進Cullin 1 neddylation,DCNL3促進cullin 3 neddylation[19]。其他E3 neddylation連接酶例如MDM2、c-CBI、parkin和IAP，均可以促進多種細胞內(nèi)蛋白發(fā)生Neddylation[22]。

圖1 Neddylation生化反應(yīng)過程Fig.1 Neddylation biochemical process

2 Deneddylation

Neddylation在去Neddylation酶的作用下，與Deneddylation維持著動態(tài)平衡。去Neddylation的酶能夠?qū)EDD8從修飾蛋白中解離下來，這些酶包括CSN(the CDP9 signalosome)、NEDP1、USP21、Ataxin-3、UCHL1和UCH-L3[3]。在這些酶中，只有CSN和NEDP1是NEDD8專一性，其他也可以調(diào)節(jié)泛素化修飾的去泛素化[23]。CSN是最具有特征性的去Neddylation酶，它在動植物中高度保守。CSN已反復(fù)被證明可以將NEDD8從Cullin蛋白和非Cullin蛋白上移除[24]。

3 Neddylation修飾對免疫細胞及炎癥因子的影響

正是因為Neddylation修飾的功能重要性，其在腫瘤、神經(jīng)發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用，下面重點介紹Neddylation修飾在調(diào)節(jié)免疫細胞中的作用。

3.1 Neddylation修飾在巨噬細胞中的作用 巨噬細胞屬于單核巨噬細胞系統(tǒng)，是固有免疫病原微生物入侵的應(yīng)答中的關(guān)鍵細胞成分[25]。巨噬細胞不僅具有吞噬功能，還具有分泌炎癥因子,調(diào)節(jié)宿主防御的能力[17]。這些炎癥介質(zhì)通過自分泌和旁分泌，影響鄰近細胞。巨噬細胞的這些介質(zhì)的分泌失調(diào),已被證明在各種疾病過程中發(fā)揮作用，包括不孕、纖維化、代謝綜合征、肝癌等[26]。最近有研究表明，MLN4924作為Neddylation的抑制劑在不影響巨噬細胞存活的情況，下調(diào)LPS誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥因子，包括IL-6、TNF-α和IL-1β[27,28]。下調(diào)IL-6和TNF-α的機制為MLN4924抑制了Cullin的Neddylation，使CRL E3酶失活，導(dǎo)致IκB-α的積累。IκB-α是CRL的底物和核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號通路的抑制劑。因此，MLN4924阻斷了NF-κB調(diào)節(jié)的炎癥因子的表達[28]。而IL-1β水平降低，是由于 MLN4924或者NEDD8缺陷影響caspase-1加工，進而影響IL-1β的成熟[27]。這表明，Neddylation途徑在調(diào)節(jié)巨噬細胞分泌炎癥介質(zhì)功能上起著重要作用，并預(yù)示Neddylation抑制劑MLN4924可以作為潛在的抗炎藥物[28]。除此之外，有文獻報道，在巨噬細胞系Raw264.7中，持久而強烈的抑制Neddylation修飾可以誘導(dǎo)巨噬細胞G2期細胞阻滯，明顯影響細胞阻滯，進一步誘導(dǎo)細胞凋亡，這說明Neddylation在影響巨噬細胞存活和增殖方面也具有非常重要的意義[29]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，Neddylation對于人類單純皰疹病毒Ⅰ 型(Herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1)誘導(dǎo)的巨噬細胞Ⅰ 型干擾素的早期產(chǎn)生是必需的[30]。HSV-1在人群中普遍感染，在80%的成年人中終身感染[31]。HSV-1主要引起口腔損害，偶爾引起夜盲和致命的散發(fā)腦炎[31]?？笻SV-1感染的固有免疫中，Ⅰ型干擾素比如IFN-β具有重要抗病毒作用[32]。Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄是由NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor，IRF)例如IRF3調(diào)節(jié)[33]。機制與上述影響TNF-α和IL-6炎癥因子的表達類似，Neddylation抑制劑MLN4924和E1酶UBA3缺陷,并未影響IRF3信號通路，而是導(dǎo)致HSV感染早期階段NF-κB信號通路的激活障礙，從而導(dǎo)致早期IFN-β產(chǎn)生減少[30]。由此可見，Neddylation對于巨噬細胞發(fā)揮抗病毒效應(yīng)早期有重要作用[30]。

3.2 T細胞 CD4+T細胞的活化是T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)和共刺激的分子通過激活某些信號通路，誘導(dǎo)其增殖，細胞因子產(chǎn)生，以及分化為輔助T細胞(TH)和記憶T細胞亞群的過程[34]。已有報道泛素和類泛素蛋白翻譯后修飾是調(diào)節(jié)T細胞功能的一個重要機制[35]。研究表明，Neddylation對于TCR誘導(dǎo)的CD4+T細胞增殖和激活是必需的[36]。TCR興奮導(dǎo)致胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)的激活需要完整的Neddylation系統(tǒng)；研究發(fā)現(xiàn)Shc蛋白是Neddylation影響ERK信號通路的靶分子，Shc蛋白促進信號復(fù)合物ZAP70-Shc-Grb2的形成，從而影響ERK信號通路下游分子的活化[36]。Neddylation E2酶UBC12表達降低會使初始CD4+T細胞比例增加，記憶CD4+T細胞比例降低；初始CD4+T細胞增殖能力也降低，UBC12敲低的CD4+T細胞增殖被阻滯在細胞周期G0/G1期，不能順利進入S 期，同時影響其向Th1和Th2 分化；但UBC12缺陷并不影響CD4+T細胞的存活[36]。進一步檢測Neddylation對CD4+T細胞產(chǎn)生細胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)TCR活化時，抑制Neddylation，使CD4+T細胞產(chǎn)生IL-2減少；UBC12敲低的脾CD4+T細胞在體外接受抗原刺激時，產(chǎn)生IFN-γ和IL-2 的能力受損，這說明Neddylation參與CD4+T細胞對抗原刺激誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生；并且UBC12敲低的CD4+T細胞在向Th1和Th2分化環(huán)境中，產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力也下降，說明Neddylation對于其向Th1和Th2 分化是必要的[36]。用MLN4924抑制Neddylation影響CD4+T細胞產(chǎn)生細胞因子的能力與敲低UBC12基因的效果相同[36]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)NEDD8途徑對Th2調(diào)節(jié)的肺部炎癥起促進作用，抑制neddylation可以減輕氣道炎癥，這也許為T細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病和自身免疫病提供了治療方法[13,36]。

3.3 樹突狀細胞 樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)對于固有免疫和適應(yīng)性免疫具有非常重要的作用[37]。DCs受到炎性刺激物、細菌以及病毒刺激，就會上調(diào)共刺激分子[38],并釋放炎性因子[39]。有研究報道，Neddylation在調(diào)節(jié)樹突狀細胞炎癥因子分泌的至關(guān)重要[40]。抑制Neddylation在未影響樹突狀細胞的存活的前提下，可以抑制DC的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和核苷酸低聚反應(yīng)區(qū)域樣受體下游信號通路激活，從而大大降低DC分泌TNF-α、IL-6炎癥因子的水平[40]。Neddylation還抑制了DC對T細胞的激活功能和產(chǎn)生干擾素-γ的能力[40]。機制為MLN4924抑制了NF-κB的激活：MLN4924抑制了IκB的降解，阻礙NF-κB的入核，并降低其活性，但是沒有影響到絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路(MAPK/ERK)[40]。炎癥因子促進很多疾病的發(fā)生，包括慢性炎癥性疾病、休克、自身免疫和移植物抗宿主免疫疾病[41,42]。因此，阻斷Neddylation也許可以緩解免疫調(diào)節(jié)性疾病的進程。

4 展望

綜上所述，Neddylation是一系列獨特的活化酶級聯(lián)反應(yīng)過程，最終使 NEDD8與底物蛋白結(jié)合，完成蛋白質(zhì)的修飾，從而調(diào)節(jié)細胞活動。雖然Neddylation研究在不斷取得重大進展,但是還有許多問題有待解決。例如，反應(yīng)體系中的酶及其底物還在不斷被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)功能也在不斷被闡明。E3連接酶對于相同的底物是如何區(qū)別Neddylation和泛素化，仍不清楚。Neddylation與疾病的關(guān)系密切，已有大量報道發(fā)現(xiàn)Neddylation促進腫瘤發(fā)生，MLN4924作為Neddylation的抑制劑已進入臨床Ⅰ 期試驗。而Neddylation與免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的關(guān)系，仍在不斷被探索發(fā)現(xiàn)。以上研究結(jié)果表明，Neddylation與免疫細胞關(guān)系密切，與炎癥性疾病和自身免疫疾病密切相關(guān)。因此，更進一步的研究Neddylation與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，可能有助于緩解免疫調(diào)節(jié)性疾病的進程。

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[收稿2016-07-19 修回2016-09-12]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.031

①本文受北京市自然科學(xué)基金(5162026)的資助。

靳家揚(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事Neddylation對巨噬細胞功能方面的研究，E-mail:861313901@qq.com。

及指導(dǎo)教師：魏 林(1961年-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫、感染免疫、補體與鏈球菌感染機制方面的研究，E-mail:weilin21@sina.com。

R392.11 R392.12

A

1000-484X(2017)05-0777-04

②福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所，福建350108。

③軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫研究室，北京100850。