張 堯，張正秀，何洪斌，劉婷婷，李貴森，王 莉(.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科暨腎臟病研究所，四川 成都 6007；.四川省攀枝花市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 攀枝花 67067)

人類免疫缺陷病毒感染合并腎臟病載脂蛋白L1基因突變檢測

張 堯1，張正秀2，何洪斌2，劉婷婷2，李貴森1，王 莉1
(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科暨腎臟病研究所，四川 成都 610072；2.四川省攀枝花市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 攀枝花 617067)

目的 檢測我國人類免疫缺陷病毒(HIV)感染合并或未合并腎損害個體進行載脂蛋白L1(apolipoprotein-L1，APOL1)基因突變。方法 分析6例HIV感染合并腎臟病患者臨床特點，并收集外周血DNA，進行APOL1調控區(qū)、編碼區(qū)基因測序，與4例HIV感染非腎臟病患者、60例地域匹配正常對照、千人基因組測序，進行突變基因頻率比較。結果 6例患者均有不同程度血尿、蛋白尿、血白蛋白降低，2例患者血肌酐升高，2例患者有血脂紊亂，1例患者合并乙肝感染，1例患者合并丙肝感染。全血DNA測序顯示1例患者攜帶APOL1基因DNA調控區(qū)A-565G雜合子突變；6例患者均攜帶APOL1基因DNA編碼區(qū)G496A(Glu166Lys)、C702A(同義突變)、G732A(Met244Lle)、G812A(Arg271Lys)、G1008A(同義突變)突變。與4例HIV感染非腎臟病患者、60例地域匹配正常對照、千人基因組測序相比，未發(fā)現(xiàn)新的突變，且突變基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義。結論 未發(fā)現(xiàn)非洲裔美國人HIV相關腎病常見的APOL1基因G1/G2突變，并且APOL1基因調控區(qū)、編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)其他特殊變異，提示我國HIV相關腎病可能存在其他危險因素。

HIV感染；腎臟??；載脂蛋白L1；基因突變

人體感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后可導致機體多個器官受累，嚴重危害健康。其中腎臟是HIV感染最常受累的器官之一，最具特征的是HIV相關腎病(HIV-associated nephropathy，HIVAN)[1，2]。HIVAN以蛋白尿、短期內(nèi)腎功能迅速減退為主要臨床表現(xiàn)，治療效果差，是導致HIV感染患者終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因[3]。研究顯示，遺傳背景在HIVAN發(fā)病中起重要作用，通過混合連鎖不平衡繪圖鑒定出染色體22q13.1區(qū)域載脂蛋白L1(APOL1)基因變異與非洲裔個體HIVAN發(fā)病密切相關，G1和G2變異攜帶者HIVAN發(fā)病風險顯著增加[4]。之前的研究在我國普通人群中未檢測到APOL1基因的G1和G2變異，是否APOL1基因的其他變異參與了我國HIVAN的發(fā)病還不清楚。本研究對我國HIV感染合并或未合并腎臟病患者進行臨床特點分析，同時對APOL1基因調控區(qū)、編碼區(qū)進行序列分析，了解有無其他特殊變異參與我國HIVAN的發(fā)病。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1～5月四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科6例來自不同家族的HIV感染合并腎臟病患者，男4例，女2例，中位年齡43歲(23～70歲)。同時收集患者高血壓、糖尿病病史，尿常規(guī)、24小時尿蛋白定量，血生化結果。納入HIV感染無腎臟病患者4例，均為男性，中位年齡72歲(32～77歲)；以及地域匹配的漢族健康對照60例，均無腎臟疾病史。本研究方案獲得我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 外周血基因組DNA提取：按照天根血液基因組DNA提取系統(tǒng)說明書進行。基因組DNA100 ng，10 μM上下游引物各1 μl，2×Taq Master Mix 12.5 μl(上海生工公司)，雙蒸水補足體系至25 μl，進行APOL1上游基因調控區(qū)1Kb、外顯子PCR擴增。擴增產(chǎn)物直接Sanger測序(北京諾賽公司)。PCR擴增引物(北京諾賽公司合成)見表1。測序結果使用Chormas對比分析。將患者APOL1基因的測序結果與HIV感染無腎臟損害患者、正常對照，以及1000 genome數(shù)據(jù)(www.1000 genomes.org)進行對比。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料用中位數(shù)表示，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIV合并/未合并腎臟病患者的臨床表現(xiàn) 6例HIV合并腎臟病患者，男4例，女2例，中位年齡43歲(23～70歲)，既往均無糖尿病、高血壓、腎臟疾病史，均有不同程度血尿、蛋白尿、血白蛋白降低，2例患者血肌酐升高，2例患者有血脂紊亂，1例患者合并乙型肝炎(HBV)感染，1例患者合并丙型肝炎(HCV)感染。平均血壓120/77 mmHg[(96～150)/(60～96)mmHg]，平均尿紅細胞60.95個/HP(7.70～951.50個/HP)，尿蛋白+(-～+)，平均血白蛋白31.05 g/L(20.20～38.00 g/L)，平均血肌酐74.50 μmol/L (56.00～114.00 μmol/L)，平均膽固醇3.10 mmol/L (1.87～30.20 mmol/L)，平均甘油三酯1.02 mmol/L (0.96～4.76 mmol/L)，平均低密度脂蛋白膽固醇1.90 mmol/L (0.38～2.92 mmol/L)，平均高密度脂蛋白膽固醇0.72 mmol/L (0.64～2.92 mmol/L)。4例HIV感染無腎臟損害的患者，1例有高血壓病史，4例均無血尿實驗室異常，無HBV、HCV合并感染。

2.2 APOL1基因測序結果 6例HIV感染合并腎臟病患者測序結果顯示：共發(fā)現(xiàn)6個基因突變位點，1個位于APOL1基因調控區(qū)A(-565)G突變，5個位于外顯子區(qū)G496A、C702A、G732A、G812A、G1008A突變。其中1例患者攜帶A-565G雜合子突變；6例患者均攜帶APOL1基因DNA編碼區(qū)G496A、C702A、G732A、G812A、G1008A點突變，分別對應氨基酸改變：Glu166Lys(錯義突變)、Ala234Ala(同義突變)、Met244Lle(錯義突變)、Arg271Lys(錯義突變)、Arg336Arg(同義突變)，其中4例患者上述5個突變位點全部為純合子突變，另外2例患者為上述位點雜合子突變。4例HIV感染無腎臟損害的患者，發(fā)現(xiàn)同樣的6個基因突變位點。其中2例患者攜帶A-565G的雜合子突變；2例患者攜帶G496A、C702A、G732A、G812A、G1008A的純合子突變、另外2例患者攜帶G496A、C702A、G732A、G812A、G1008A的雜合子突變。

2.3 APOL1基因突變的頻率分布差異比較 本研究發(fā)現(xiàn)的APOL1基因6個變異位點，除G496A、C702A、G732A及G812A四個位點等位基因頻率與非洲裔個體有明顯差異外，與4例HIV感染無腎臟病對照、60例無HIV感染正常對照、千人基因組中亞裔對照、千人基因組所有數(shù)據(jù)進行比較，突變基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。見表2。

表2 APOL1基因多態(tài)性位點突變基因頻率分布

3 討論

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)目前已成為全球性威脅健康的公共問題[5]。非洲裔美國人CKD發(fā)病率較高，且容易發(fā)展為ESRD，與歐洲裔美國人相比，ESRD發(fā)病率高出4倍，提示存在強烈遺傳差異[6]。非洲裔黑人中，HIVAN比例較高，常常表現(xiàn)為不可逆的慢性腎臟損害，ESRD發(fā)生率及死亡率較高。非洲HIV患者CKD發(fā)病率6.0%～48.5%，其中南非24%～83%是典型的HIVAN[7]。本研究中，10例HIV感染患者中，6例有腎臟損害，其中2例已經(jīng)出現(xiàn)血肌酐升高，提示其腎臟損害預后不良。

1999年Freedman等報道HIVAN是非洲裔美國人的ESRD家族聚集性的重要因素，并提出遺傳背景差異是非洲裔美國人HIVAN和其他腎臟疾病的重要發(fā)病機制[8]。2008年Kao等報道MYH9基因多態(tài)性與非洲裔美國人ESRD的發(fā)病相關[9]，同時Kopp等發(fā)現(xiàn)該基因的變異與局灶節(jié)段腎小球硬化發(fā)病相關[10]。后來Genovese 等發(fā)現(xiàn)與非洲裔美國人CKD發(fā)病相關可能主要為MYH9相鄰的APOL1基因變異[11]。APOL1中G1、G2突變常見于非洲人、非洲裔美國人，但歐洲人、亞洲人是缺乏的[12]。隱形遺傳模型下，攜帶APOL1風險等位基因，局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)風險增加17倍，HIVAN風險增加29倍[13]。但并不增加合并糖尿病的腎臟病、IgA腎病的患病風險[14]。有研究顯示，攜帶APOL1兩個風險等位基因的非洲裔美國人HIV患者，若不治療，50%將發(fā)展為HIVAN[15]。APOL1基因突變破壞細胞保護性自噬，可為其導致腎臟病變的發(fā)病機制之一[16]。然而我國目前尚未有HIVAN患者APOL1基因變異的研究報道。

本研究納入HIV感染合并及未合并腎臟損害的兩類患者，均進行上游調控區(qū)和外顯子測序，結果所發(fā)現(xiàn)的突變在正常對照及千人基因組中均有報道，且突變頻率相似，提示可能不是特異的致病性突變。這一結果有以下兩種可能，一是我國HIVAN患者存在低頻率APOL1突變的可能；另一個可能性是這些患者存在其他基因變異導致其易發(fā)生HIVAN的可能性，均需要進行更大樣本的研究。但不論是患者還是對照組個體，均未檢測出APOL1基因G1、G2突變，提示我國人群APOL1基因變異與非洲裔個體存在明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)兩例患者分別合并HBV感染和HCV感染，既往報道，亞洲HIV患者，HIV/HBV合并感染患病率達到20%～30%，研究證實HIV/HBV合并感染可促進HBV復制、減低其自發(fā)分解，既往感染再燃風險增加，肝硬化、肝癌等合并癥進展加速[17]。HIV/HCV合并感染增加腎小球濾過率降低、蛋白尿的風險[18]。APOL1基因 G1、G2突變是非洲裔個體CKD的易感因素，而此突變?yōu)楣δ塬@得性，獲得抗錐蟲能力，但增加腎臟病風險[19]。APOL1溶解錐蟲的能力為非洲人群面對這種病原體的進化適應性選擇，這個選擇性優(yōu)勢改變了非洲地區(qū)的人群攜帶APOL1基因突變頻率的分布[20]。這也解釋了亞洲及歐洲無APOL1基因G1、G2突變原因。我們的研究顯示與非洲裔個體有差異，但與其他亞裔無差異。

綜上所述，我國目前未發(fā)現(xiàn)非洲裔美國人HIVAN發(fā)病中常見的APOL1基因G1和G2突變，并且APOL1基因調控區(qū)、編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)其他特殊變異，提示我國HIVAN可能存在其他遺傳變異背景。

[1] Klag MJ，Whelton PK，Randall BL，et al.End-stage renal disease in African-American and white men.16-year MRFIT findings[J].JAMA，1997，277(16)：1293-1298.

[2] Fabian J，Naicker S.HIV and kidney disease in sub-Saharan Africa[J].Nat Rev Nephrol，2009，5(10)：591-598.

[3] Rao TK.Human immunodeficiency virus infection and renal failure[J].Infect Dis Clin North Am，2001，15(3)：833-850.

[4] Kruzel-Davila E，Wasser WG，Aviram S，et al.APOL1 nephropathy：from gene to mechanisms of kidney injury[J].Nephrol Dial Transplant，2016，31(3)：349-358.

[5] Ojo A.Addressing the global burden of chronic kidney disease through clinical and translational research[J].Trans Am Clin Climatol Assoc，2014，125：229-226.

[6] Collins AJ，F(xiàn)oley RN，Chavers B，et al.’United States Renal Data System 2011 Annual Data Report：Atlas of chronic kidney disease & end-stage renal disease in the United States[J].Am J Kidney Dis，2012，59(Suppl 1)：420.

[7] Kasembeli AN，Duarte R，Ramsay M，et al.African origins and chronic kidney disease susceptibility in the human immunodeficiency virus era[J].World J Nephrol，2015，4(2)：295-306.

[8] Freedman BI，Soucie JM，Stone SM，et al.Familial clustering of end-stage renal disease in blacks with HIV-associated nephropathy[J].American Journal of Kidney Diseases，1999，34(2)：254-258.

[9] Kao WH，Klag MJ，Meoni LA，et al.MYH9 is associated with nondiabetic end-stage renal disease in African Americans[J].Nature Genetics，2008，40(10)：1185-1192.

[10]Kopp JB，Smith MW，Nelson GW，et al.MYH9 is a major-effect risk gene for focal segmental glom-erulosclerosis.Nat Genet[J].Nature Genetics，2008，40：1175-1184.

[11]Genovese G，F(xiàn)riedman DJ，Ross MD，et al.Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans[J].Science，2010，329(5993)：841-845.

[12]Pollak MR，Genovese G，F(xiàn)riedman DJ.APOL1 and kidney disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2012，21(2)：179-182.

[13]Kopp JB，Nelson GW，Sampath K，et al.APOL1 genetic variants in focal segmental glomerulosclerosis and HIV-associated nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2011，22(11)：2129-2137.

[14]Papeta N，Kiryluk K，Patel A，et al.APOL1 variants increase risk for FSGS and HIVAN but not IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2011，22(11)：1991-1996.

[15]Naicker S，Rahmanian S，Kopp JB.HIV and chronic kidney disease[J].Clin Nephrol，2015，83(7 Suppl 1)：32-38.

[16]Kimura T，Takabatake Y，Takahashi A，et al.Autophagy protects the proximal tubule from degeneration and acute ischemic injury[J].J Am Soc Nephrol，2011，22(5)：902-913.

[17]Genovese G，F(xiàn)riedman DJ，Ross MD，et al.Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans[J].Science，2010，329(5993)：841-845.

[18]di Belgiojoso GB，F(xiàn)errario F，Landriani N.Virus-related glomerular diseases：histological and clinical aspects[J].J Nephrol，2002，15(5)：469-479.

[19]Friedman DJ，Kozlitina J，Genovese G，et al.Population-based risk assessment of APOL1 on renal disease[J].J Am Soc Nephrol，2011，22(11)：2098-2105.

[20]Fabrizi F，Dixit V，Martin P，et al.Hepatitis C virus increases the risk of kidney disease among HIV-positive patients：Systematic review and meta-analysis[J].J Med Virol，2016，88(3)：487-497.

Detection of APOL1 gene mutation in HIV infection complicated with kidney disease

ZHANGYao1，ZHANGZheng-xiu2，HEHong-bin2，LIUTing-ting2，LIGui-sen1，WANGLi1
(1.DepartmentofNephrology&NephrologyInstitute，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.DepartmentofNephrology，PanzhihuaCityCentralHospital，Panzhihua617067，China)

LIGui-sen

Objective To detect the mutation of apolipoprotein-L1 (APOL1) in HIV patients complicated with kidney disease.Methods We analyzed the clinical characteristics of six HIV patients complicated with kidney disease.Then，we collected peripheral blood cell DNA and performed sequence analysis of the regulatory and coding regions in APOL1 gene.Finally，we compared the frequencies of the mutant alleles of the six patients with four HIV-infected patients without kidney disease and 60 matched normal controls as well as 1000 genomes project data.Results All the six cases presented different degrees of microscopic hematuria，proteinuria，serum albumin reduction.There were two patients with increased serum creatinine level，two with dyslipidemia，one with concomitant hepatitis B virus infection and one with concomitant hepatitis C virus infection.The whole blood DNA sequence analysis showed that there was a patient with a heterozygous mutation in the regulatory region (A-565G).Five mutations in coding region at G496A (Glu166Lys)，C702A (synonymous mutation)，G732A (Met244Lle)，G812A (Arg271Lys)，and G1008A (synonymous mutation) were found in all the six cases.Compared to the four HIV-infected patients without kidney disease，60 matched normal controls，and 1000 genomes project data，the frequencies of these variants were not statistically different.Conclusion No APOL1 G1/G2 mutations that were common in African Americans with HIV infection complicated with kidney disease are found in this study.There is also no other special variation of APOL1 gene in these patients.It may suggest that there could be other risk factors for the disease in our country.

Human immunodeficiency virus；Kidney disease；Apolipoprotein L1；Mutation

李貴森

R692；R512.91

A

1672-6170(2017)02-0025-04

2016-09-23；

2016-11-24)