黃馳雄，景遠(yuǎn)文，李海瑞，王世飛，楊莉，賓建平

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515)

不同能量超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子和VEGF表達(dá)的影響

黃馳雄，景遠(yuǎn)文，李海瑞，王世飛，楊莉，賓建平

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515)

目的 探索不同能量超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使培養(yǎng)液中微泡濃度為1×107/mL,根據(jù)接受超聲能量處理情況將內(nèi)皮細(xì)胞分為0、1.0、2.0、3.0、4.0 MPa 5組。超聲處理1.5 h后采用全自動酶標(biāo)儀檢測活性氧(ROS)表達(dá)熒光強度，8 h后 采用MTT、Western blotting和免疫熒光分別檢測內(nèi)皮細(xì)胞活性以及VEGF、 P選擇素表達(dá)。同時2.0 MPa組中加入ROS抑制劑(GSH)或P選擇素抑制劑(rPSLG-Ig)，8 h后檢測VEGF表達(dá)。結(jié)果 與0 MPa組相比，1.0 、2.0 MPa組內(nèi)皮細(xì)胞活性無變化(P均>0.05)，3.0、4.0 MPa組內(nèi)皮細(xì)胞活性降低(P均<0.05)。與0 MPa組相比，1.0、2.0、3.0、4.0 MPa 組ROS、P選擇素和VEGF的表達(dá)增高(P均<0.05)。3.0 MPa組與4.0 MPa組比較ROS、P選擇素和VEGF的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。2.0 MPa組中加入GSH或rPSLG-Ig后，VEGF表達(dá)低于單純2.0MPa組(P均<0.05)。結(jié)論 超聲破壞微泡可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管再生；其中超聲能量2.0MPa對內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)和VEGF的影響較理想。

內(nèi)皮細(xì)胞；血管生成；超聲；微泡；炎性反應(yīng)；血管內(nèi)皮生長因子

目前，現(xiàn)代再灌注治療手段如搭橋術(shù)、經(jīng)皮介入治療等能較明顯地改善冠心病患者的癥狀及預(yù)后[1]，但無法避免血管再狹窄，對直徑較小的血管亦無有效干預(yù)方法[2]。因此，促血管新生治療有望成為現(xiàn)代再灌注治療手段的重要補充。研究顯示，超聲破壞微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)可在體內(nèi)外引起多種生物學(xué)效應(yīng)，具有促血管生成的潛能，但較高能量的超聲可能對細(xì)胞或較脆弱的新生血管產(chǎn)生損傷。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促進(jìn)血管新生的重要因子，P選擇素、活性氧(ROS)等炎性介質(zhì)與VEGF的表達(dá)高度相關(guān)[3]。2016年7～11月，本研究于體外通過不同能量超聲破壞微泡刺激內(nèi)皮細(xì)胞，以探討其對細(xì)胞活性和細(xì)胞ROS、P選擇素、VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及微泡制備 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUvE-12)(廣州吉賽生物)用含有10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗的DMEM-F12(均為Gibco產(chǎn)品，美國)培養(yǎng)基在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇后至少傳代3次才用于實驗干預(yù)。采用既往報道方法[4]制備全氟丙烷脂質(zhì)微泡，使干預(yù)細(xì)胞時培養(yǎng)基中微泡濃度為1×107/mL。

1.2 細(xì)胞分組及活性檢測 取對數(shù)期內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化后用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，保持培養(yǎng)液中微泡濃度為1×107/mL。把內(nèi)皮細(xì)胞分為5個不同超聲能量處理組(0、1.0、2.0、3.0、4.0 MPa組)，用超聲空化治療儀進(jìn)行輻照破壞微泡。然后每個處理組接種3個復(fù)孔，并設(shè)置3個空白對照孔，每孔接種1×104個細(xì)胞于96孔板。8 h后用MTT試劑盒檢測吸光度，以空白對照孔細(xì)胞活性為100%計算5個處理組的細(xì)胞活性。

1.3 內(nèi)皮細(xì)胞ROS表達(dá)檢測 將5×105細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞分組和微泡濃度同前。超聲干預(yù)后再培養(yǎng)1.5 h，用無血清培養(yǎng)基洗3次，避光條件下加入含1 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。用胰酶把細(xì)胞消化并用200 μL PBS重懸，加入96孔板于全自動酶標(biāo)儀下檢測ROS熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm)，每組重復(fù)3次。

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素表達(dá)檢測 將5×104細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞分組和微泡濃度同前。超聲干預(yù)后再培養(yǎng)8 h。取出細(xì)胞PBS洗3次，然后用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗去多聚甲醛，1%的BSA封閉液封閉20 min。用兔抗大鼠P選擇素一抗(1∶300)4 ℃孵育過夜，洗去一抗，避光條件下用羊抗兔二抗Alexa488(1∶300)孵育30 min。避光洗去二抗，DAPI染色5 min后用PBS洗3次，吸盡皿中的PBS常溫下避光涼干。最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)檢測 將5×105細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞分組和微泡濃度同前。超聲干預(yù)之后再培養(yǎng)8 h。取出細(xì)胞PBS洗3次，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測蛋白濃度。10%的SDS凝膠電泳1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%的BSA封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜。TBST洗3次(5 min/次)后二抗孵育1 h，TBST洗3次(10 min/次)并晾干，最后用ODYSSEY近紅外成像系統(tǒng)曝光條帶。Western blotting方法檢測5組細(xì)胞VEGF的表達(dá)以及2.0 MPa時分別加入ROS抑制劑(GSH)或P選擇素抑制劑(rPSLG-Ig)時內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同能量超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 0、1.0、2.0、3.0、4.0 MPa 5組細(xì)胞活性分別為(99.80±9.15)%、(97.41±8.29)%、(98.64±9.72)%、(75.86±8.71)%、(61.08±7.74)%。與0 MPa組相比，1.0、2.0 MPa組細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，3.0 MPa組和4.0 MPa組細(xì)胞活性顯著降低(P均<0.05)。同時，4.0 MPa組細(xì)胞活性也顯著低于3.0 MPa組(P<0.05)。

2.2 不同能量超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞ROS和P選擇素表達(dá)影響 0、1.0、2.0、3.0、4.0 MPa 5組細(xì)胞ROS熒光強度分別為24.51±6.83、304.36±57.82、1 200.17±98.95、1 905.24±139.83、2 001.64±115.49。3.0 MPa組和4.0 MPa組ROS熒光強度達(dá)到同一平臺水平，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其余各組間細(xì)胞ROS熒光強度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。P選擇素的表達(dá)與ROS的變化趨勢相同，也隨著超聲強度的增加而增加，3.0 MPa和4.0 MPa時達(dá)到同一平臺水平。

2.3 不同能量超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)影響 0 MPa組無VEGF表達(dá)。隨著超聲強度的增加，VEGF的表達(dá)逐漸增高，但3.0 MPa組和4.0MPa組細(xì)胞VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其余各組間細(xì)胞VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。在2.0 MPa組中加入GSH或者rPSLG-Ig時，VEGF的表達(dá)相對于單純2.0 MPa處理組顯著下降(P均<0.05)。見圖1。

注：A、B:不同超聲能量時VEGF表達(dá)差異。C、D：2.0 MPa時加入GSH或rPSLG-Ig VEGF表達(dá)變化。

圖1 超聲破壞微泡對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)量的影響

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、外周血管病等缺血性疾病發(fā)病率、致殘率高，現(xiàn)代再灌注治療手段如搭橋術(shù)、經(jīng)皮介入治療等能較明顯地改善疾病的癥狀及預(yù)后，但仍具有一定局限性，如血管再狹窄、無法干預(yù)直徑較小的血管等。促血管新生治療亦被稱為分子搭橋[5]，有望成為上述現(xiàn)代再灌注治療手段的重要補充。

目前促血管新生的主要方法是外源性注射干細(xì)胞[6]、促血管形成因子或相關(guān)基因[7]，但因靶向性較低的問題，其促血管生成的效果欠理想。超聲破壞微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)可在體內(nèi)外引起多種生物學(xué)效應(yīng)，具有促血管生成的潛能。Song等[8]研究發(fā)現(xiàn)，超聲破壞微泡可促進(jìn)大鼠缺血后肢的血管新生、改善缺血組織血供，但對其具體機制尚不清楚。

既往研究提示，低能超聲破壞微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)可誘導(dǎo)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，ROS、P選擇素表達(dá)增高[9]；亦有研究證實，P選擇素、ROS等炎性介質(zhì)增高與VEGF的表達(dá)相關(guān)[3]；同時大量研究已證實，VEGF可有效促進(jìn)血管新生、改善組織血供[10]。因此我們假設(shè)超聲破壞微泡可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)而增加VEGF的表達(dá)量，從而促進(jìn)缺血組織的血管生成。Song等[8]在大鼠后肢缺血模型中發(fā)現(xiàn)超聲破壞微泡可促進(jìn)大鼠后肢的血管生成、增加肌肉血流灌注，但并未對具體機制進(jìn)行闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，超聲破壞微泡可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，這與Nazer 等[11]研究結(jié)果相似，但Nazer 等未對VEGF表達(dá)增加的相關(guān)分子機制進(jìn)行研究。從理論上而言，較高能量的超聲除可能對脆弱的新生血管產(chǎn)生破壞外，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。因此，探討既能有效促進(jìn)血管新生而又不產(chǎn)生血管損傷及細(xì)胞壞死的超聲能量十分重要。

我們發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)(≤ 2.0 MPa)隨著能量的增加，超聲破壞微泡使內(nèi)皮細(xì)胞ROS、P選擇素和VEGF的表達(dá)量逐漸增高，且細(xì)胞活性未發(fā)生明顯改變；當(dāng)能量為3.0 MPa時，這三種分子的表達(dá)量進(jìn)一步增高，但細(xì)胞活性明顯下降；當(dāng)能量為4.0 MPa時，這三種分子的表達(dá)量不再增高，且細(xì)胞活性進(jìn)一步下降。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入ROS和P選擇素抑制劑后，VEGF表達(dá)量明顯下降。這提示超聲破壞微泡可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)而增加VEGF的表達(dá)，2.0 MPa是較理想的超聲能量。

需要說明的是，本研究僅局限于體外的內(nèi)皮細(xì)胞試驗，未進(jìn)行相關(guān)動物研究。我們后續(xù)研究擬在大鼠缺血性心臟病模型中探討超聲破壞微泡促進(jìn)血管生成的具體機制及最佳能量，為超聲破壞微泡促進(jìn)血管生成用于治療缺血性疾病提供理論依據(jù)。

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Effects of different pressure of ultrasound-targeted microbubble destruction on expression of inflammatory factor and VEGF

HUANGChixiong,JINGYuanwen,LIHairui,WANGShifei,YANGLi,BINJianping

(NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To explore the influence of different pressure of ultrasound-targeted microbubble destruction on the expression of inflammatory factor and vascular endothelial growth factor (VEGF) in human umbilical vein endothelial cells (HUvE-12 cells).Methods We cultured HUvE-12 cells in the DMEM-F12 medium containing 1×107/mL microbubbles. HUvE-12 cells were divided into 5 groups exposed to different ultrasound pressure (0, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 MPa). After 1.5 h of ultrasound exposure, we detected the expression of reactive oxygen species (ROS) by using full-automatic microplate reader. At 8 h after corresponding interventions, the cell viability, P-selectin and VEGF expression was determined by MTT, immunofluorescence and Western blotting, respectively. Additionally, ROS inhibitor (GSH) or P-selectin inhibitor (rPSLG-Ig) were added into the 2.0 MPa group, and VEGF expression was determined by Western blotting, respectively. Results The cell viability presented to be no difference in the 1.0 MPa and 2.0 MPa groups as compared with 0 MPa group (all P>0.05), while it decreased significantly in the 3.0 MPa and 4.0 MPa groups (allP<0.05). The expression of ROS, P-selectin and VEGF increased in the 1.0, 2.0, 3.0, and 4.0 MPa groups as compared with that of the 0 MPa group (allP<0.05). No difference was found in the expression of ROS, P-selectin and VEGF between the 4.0 MPa and 3.0 MPa groups (allP>0.05). When GSH or rPSLG-Ig were added in the 2.0 MPa group , the expression of VEGF was inhibited significantly as compared with that of 2.0 MPa applied only (allP<0.05). Conclusion Ultrasound-targeted microbubble destruction can increase the expression of VEGF through inducing inflammatory reaction and promote angiogenesis, and 2.0 MPa is the optimal ultrasound pressure.

endotheliocytes; angiogenesis; ultrasound; microbubbles; inflammatory reaction; vascular endothelial growth factor

國家自然科學(xué)基金面上項目(81571698)。

黃馳雄(1991-)，男，在讀碩士，研究方向為超聲微泡在疾病診斷和治療中的應(yīng)用。E-mail：435683314@qq.com

賓建平(1964-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為超聲微泡在疾病診斷和治療中的應(yīng)用。E-mail：jianpingbin@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.002

R541.4

A

1002-266X(2017)17-0004-03

2016-12-14)