趙軼男，劉 安，付 瑩，張樹彪

(大連民族大學(xué) 教育部生物技術(shù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605)

陽離子脂質(zhì)體基因載體的穩(wěn)定性研究

趙軼男，劉 安，付 瑩，張樹彪

(大連民族大學(xué) 教育部生物技術(shù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605)

從陽離子脂質(zhì)體的形態(tài)、平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位及濁度等方面，考察了季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體CPA14的穩(wěn)定性。經(jīng)透射電子顯微鏡檢測，陽離子脂質(zhì)體呈球形結(jié)構(gòu)，粒徑為100～200 nm。經(jīng)粒度分析儀檢測，陽離子脂質(zhì)體平均粒徑為210～260 nm，顆粒分布均勻，Zeta電位為55～90 mV。脂質(zhì)體在4 ℃條件下存放3個(gè)月，外觀無明顯變化，脂質(zhì)體的濁度變化不大。證實(shí)季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體CPA14穩(wěn)定性良好，適合用作基因載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)運(yùn)。陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA在N:P質(zhì)量比為3:1時(shí)可高效轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞，與商品轉(zhuǎn)染試劑DOTAP轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)。為新型季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體基因載體的構(gòu)建提供了理論依據(jù)。

陽離子脂質(zhì)體；粒徑；Zeta電位；濁度；轉(zhuǎn)染效率

在基因治療發(fā)展的幾十年里，全世界啟動(dòng)了超過1 500個(gè)基因轉(zhuǎn)染的基因治療臨床試驗(yàn)。1990年美國國立衛(wèi)生研究院采用基因治療方法對腺苷脫氨酶缺陷癥進(jìn)行治療，首次將基因治療應(yīng)用到臨床并取得了成功[1]。2000年法國采用基因治療方法成功治療聯(lián)合免疫缺陷綜合癥[2]，從此證實(shí)了基因治療策略的有效性?；蛑委熞玫竭M(jìn)一步的發(fā)展，必須獲得具有靶向性的高效的基因?qū)胂到y(tǒng)。陽離子脂質(zhì)體是目前研究最透徹、技術(shù)最成熟、應(yīng)用最廣泛的非病毒基因載體系統(tǒng)，具有制備容易、無免疫原性、緩釋性能好、外源基因容納量不受限制等優(yōu)點(diǎn)[3]。但由于其體內(nèi)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短，轉(zhuǎn)染效率低等問題，限制了陽離子脂質(zhì)體基因載體的臨床應(yīng)用。而陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性是導(dǎo)致這些問題的重要因素之一。脂質(zhì)體膜是動(dòng)態(tài)膜，磷脂分子間不斷交換位置，脂質(zhì)體顆粒可自發(fā)聚集、沉降，造成脂質(zhì)體的不穩(wěn)定[4]。而陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性能延長陽離子脂質(zhì)體載體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，延緩藥物的釋放，為持續(xù)靶向給藥提供方便，能獲得良好的治療效果[5-6]。

本文選取課題組合成的季銨鹽型陽離子類脂CPA14與助類脂二油?；字Ｒ掖及?DOPE)結(jié)合制備陽離子脂質(zhì)體，其中CPA14的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。通過激光粒度儀測定脂質(zhì)體的平均粒徑、粒徑分布及Zeta電位；通過透射電子顯微鏡測定脂質(zhì)體的形態(tài)變化；采用濁度計(jì)測量脂質(zhì)體的濁度變化。從陽離子脂質(zhì)體的物理化學(xué)性質(zhì)方面考察了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，并將陽離子脂質(zhì)體作為基因載體運(yùn)載質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，考察脂質(zhì)體基因載體的體外轉(zhuǎn)染效率，從而為季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

圖1 季銨鹽型陽離子類脂CPA14的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

陽離子類脂CPA14(課題組合成)；二油?；字Ｒ掖及?DOPE，上海西格瑪有限公司)；人宮頸癌細(xì)胞Hela(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethy-lammonium-propane(chloride salt)，DOTAP，美國Roche公司)；質(zhì)粒pGFP-N2(含綠色熒光蛋白基因，實(shí)驗(yàn)室提取)；磷酸鹽緩沖液(DPBS，生工生物工程(上海)股份有限公司)；Opti-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)。

攜Zeta電位測定與納米激光散射粒度分布儀(SZ-100，日本HORIBA公司)；濁度計(jì)(WGZ-2000，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)；超純水儀(美國Millipore公司)；倒置熒光顯微鏡(IX71，日本Olympus公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3750，日本三洋公司)。

1.2 陽離子脂質(zhì)體的制備

按照1:1摩爾比準(zhǔn)確稱取類脂CPA14和DOPE，加入氯仿溶解，在N2下吹干形成均勻薄膜。將膜置于真空干燥箱過夜，準(zhǔn)確加入0.5 mL預(yù)熱的無水乙醇和4.5 mL超純水，浸泡2 h。反復(fù)超聲振蕩處理，使膜充分溶解以至澄清，即得到陽離子脂質(zhì)體，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3 脂質(zhì)體的平均粒徑及Zeta電位測定

陽離子脂質(zhì)體每隔15天測定其平均粒徑和Zeta電位，通過攜Zeta電位測定與納米激光散射粒度分布儀測量，測定前將脂質(zhì)體經(jīng)超聲處理后，用超純水稀釋，1 mL超純水加入20 μL脂質(zhì)體樣品。檢測條件為波長630 nm的氦-氖激光，重復(fù)測量3次。

1.4 陽離子脂質(zhì)體的形態(tài)測定

脂質(zhì)體的形態(tài)主要是通過負(fù)染色透射電子顯微鏡(TEM)來表征。陽離子脂質(zhì)體超聲10 min，400目碳膜銅網(wǎng)吸附脂質(zhì)體20～30 min，滴上2%磷鎢酸染色30 s，干燥后在透射電鏡下觀測并照相，加速電壓200 kV，檢測最小物鏡光闌孔為20～30 μm，放大倍數(shù)為15～30 K[4]。

1.5 陽離子脂質(zhì)體的濁度檢測

陽離子脂質(zhì)體濁度測定通過WGZ-2000型濁度計(jì)測定，測定前將脂質(zhì)體超聲處理，準(zhǔn)確移取脂質(zhì)體20 μL，用1 mL超純水稀釋，樣品測量重復(fù)5次，儀器穩(wěn)定顯示的讀數(shù)即為被測樣品濁度值。

1.6 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因

將Hela細(xì)胞種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含雙抗和血清)400 μL，濃度約為1.0×106個(gè)/孔。將細(xì)胞放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，使在轉(zhuǎn)染日細(xì)胞密度達(dá)80%～90%。移去生長培養(yǎng)基，用等量DME培養(yǎng)基(無血清)清洗，再用等量DMEM培養(yǎng)基(無血清)替換。將脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物100 μL，加到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 h，更換含10%血清和抗生素的培養(yǎng)基，培育48 h。采用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行基因表達(dá)分析，觀察倍數(shù)20×10。

2 結(jié)果與討論

2.1 陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

圖2 陽離子脂質(zhì)體三個(gè)月內(nèi)的濁度變化

2.2 陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑

脂質(zhì)體的粒徑對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響很大，粒徑較大的脂質(zhì)體(>300 nm) 缺乏血管通透性，不能通過肝血管的細(xì)胞間隙，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，故在體內(nèi)的半衰期較短。粒徑小于300 nm的脂質(zhì)體可以減少肝、脾的攝取，增加靶部位的聚集，延長其在血液中的半衰期[7-9]。另外，不同大小的脂質(zhì)體融合和聚集的程度不同，也會(huì)影響脂質(zhì)體的儲(chǔ)存時(shí)間。陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3。

圖3 陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑

本文方法制得的陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑在210～260 nm，隨著脂質(zhì)體放置時(shí)間的增加，粒徑?jīng)]有明顯變化。脂質(zhì)體的粒徑分布通常用多分散性系數(shù)PDI值表示，PDI值越小，表明粒徑分布的范圍越窄，說明分散體系中顆粒的粒徑具有較好的規(guī)整度和均一性，通常認(rèn)為較小的粒度分布對應(yīng)脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性，適于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的應(yīng)用；PDI值越大，越接近于1，表明脂質(zhì)體顆粒分布越不均一[10-11]。本文所制備脂質(zhì)體的PDI值都在0.3左右，脂質(zhì)體的有效粒徑分布均較窄，說明陽離子脂質(zhì)體顆粒分布比較均勻。

2.3 陽離子脂質(zhì)體的Zeta電位

脂質(zhì)體表面帶電性的一個(gè)重要指標(biāo)就是Zeta電位，Zeta電位的大小可以預(yù)測脂質(zhì)體系是否穩(wěn)定[12]。Zeta電位越大表示脂質(zhì)體表面所帶電荷越多，可使由雙電層引起的靜電斥力增大，凝聚時(shí)要克服的能量越大，越不易產(chǎn)生凝聚，從而增加脂質(zhì)體穩(wěn)定性。此外，Zeta電位的高低還表明了其壓縮DNA的能力，一般來說，Zeta電位越大，其壓縮DNA的量越多，但同時(shí)細(xì)胞的毒性也越大，因此要將脂質(zhì)體的Zeta電位控制在一個(gè)合適的范圍。通常情況下，脂質(zhì)體Zeta電位絕對值小于30 mV時(shí)，荷電粒子不穩(wěn)定，容易聚集；脂質(zhì)體Zeta電位絕對值大于30 mV時(shí)，具有較好的靜電穩(wěn)定性；而絕對值大于60 mV，已經(jīng)相當(dāng)穩(wěn)定[13]。制備的陽離子脂質(zhì)體的電位分布和Zeta電位如圖4。

圖4 陽離子脂質(zhì)體的Zeta電位

3個(gè)月內(nèi)脂質(zhì)體的Zeta電位在55～90 mV變化，具有一定的電荷穩(wěn)定性，可保證陽離子脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

2.4 陽離子脂質(zhì)體的形態(tài)

透射電子顯微鏡是表征分子有序組合體微觀形態(tài)的最直觀檢測手段，本文采用透射電子顯微鏡觀察所制備脂質(zhì)體的形態(tài)。采用負(fù)染色技術(shù)將脂質(zhì)體滴加在附有碳膜的銅網(wǎng)上，以2%磷鎢酸水溶液對脂質(zhì)體的背景進(jìn)行染色，脂質(zhì)體被高密度的磷鎢酸染色劑包圍形成背景。背景對電子束產(chǎn)生散射作用，相對較暗，而大多數(shù)電子束可以穿過脂質(zhì)體，于是屏幕上就形成了暗色背景下脂質(zhì)體較亮的圖像。這種方法能較好地觀察脂質(zhì)體的二維結(jié)構(gòu)，但不能觀察其三維表面特征，脂質(zhì)體透射電鏡結(jié)果如圖5。

陽離子脂質(zhì)體放置三個(gè)月后，電鏡觀察形態(tài)相差不大，脂質(zhì)體基本為球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑在100 nm以內(nèi)，顆粒分布比較均勻。對比圖3可看出，由電鏡測得的粒徑相對于粒度儀測得的平均粒徑要小。這是因?yàn)殡婄R是極少的點(diǎn)面靜態(tài)顆粒測量，粒度儀是立體的、大量的、動(dòng)態(tài)測量；另外，脂質(zhì)體失水后，粒徑也要變小一些。由電鏡圖可以看出，脂質(zhì)體平均粒徑較小，形態(tài)相差不大，分布較為均勻，說明脂質(zhì)體具有很好的穩(wěn)定性。

圖5 陽離子脂質(zhì)體透射電鏡(加速電壓100kV)

2.5 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因

質(zhì)粒pGFP-N2中含有綠色熒光蛋白基因，基因表達(dá)的產(chǎn)物含有綠色熒光蛋白(GFP)，陽性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，GFP陽性細(xì)胞越多，信號(hào)越強(qiáng)，表明轉(zhuǎn)染效率越高，可以定性分析脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率[14-16]。選取制備三個(gè)月后的脂質(zhì)體CPA14，與質(zhì)粒DNA按質(zhì)量比(N:P)為1:1，3:1，6:1和8:1分別制備脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染對數(shù)增殖期的Hela細(xì)胞，定性分析陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖6。

圖6 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)pGFP-N2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)

在N:P比為1時(shí)，陽離子脂質(zhì)體壓縮的質(zhì)粒DNA量較少，轉(zhuǎn)染效率不高；當(dāng)N:P比為6和8時(shí)，由于陽離子脂質(zhì)體用量相對較大，可能會(huì)對Hela細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率降低。陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA以3:1質(zhì)量比制備的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物能高效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，且與商品轉(zhuǎn)染試劑DOTAP轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)。

3 結(jié) 論

本文通過對季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體CPA14的平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位及濁度等方面的研究，考察了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。所制備的陽離子脂質(zhì)體澄清透明，在4 ℃條件下存放3個(gè)月，外觀無明顯變化，無沉淀析出，穩(wěn)定性較好。經(jīng)透射電子顯微鏡檢測，陽離子脂質(zhì)體呈球形結(jié)構(gòu)，粒徑小于100 nm；經(jīng)粒度分析儀檢測，陽離子脂質(zhì)體的粒徑在210～260 nm，脂質(zhì)體的PDI 值均在0.3左右，粒徑分布較均一，粒徑分散均勻，Zeta電位為55～90 mV，具有一定的電荷穩(wěn)定性。脂質(zhì)體的濁度在7.0 NTU左右，且隨著時(shí)間的增加并無明顯變化，具有良好的穩(wěn)定性。陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA在N:P質(zhì)量比為3:1時(shí)可高效轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞，與商品轉(zhuǎn)染試劑DOTAP相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所構(gòu)建的季銨鹽型陽離子脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性，滿足作為基因轉(zhuǎn)染載體的條件，有適于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染的應(yīng)用潛力，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1] CRYSTAL R G. Transfer of genes to humans: Early lessons and obstacles to success [J]. Science, 1995, 270(5235): 404-410.

[2] CAVAZZANA C M, HACEIN B S, SAINT B G, et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease [J].Science, 2000,288: 669-672.

[3] ZHAO Y N, ZHANG S B, CUI S H, et al. Peptides-based cationic liposomes-mediated gene delivery [J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2012, 9(1): 127-139.

[4] ZHAO Y N, ZHANG S B, ZHANG Y, et al. Tri-peptide cationic lipids for gene delivery [J]. Journal of Material Chemistry B, 2015, 3: 119-126.

[5] WASUNGU L, HOEKSTRA D. Cationic lipids, lipoplexes and intracellular delivery of genes[J]. Controlled Release, 2006, 116(2): 255-264.

[6] 趙軼男, 張樹彪, 崔韶暉, 等. 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(10): 1459-1464.

[7] 趙軼男, 張樹彪, 崔韶暉, 等. 膽固醇嵌入式陽離子脂質(zhì)體運(yùn)載基因研究[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(9): 1257-1261.

[8] KREUTER J. Nanoparticulate systems for brain delivery of drugs [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, 47(1): 65-81.

[9] FRIEND D S, PAPAHADJOPOULOS D, DEBS R J. Endocytosis and in-tracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes [J]. Biochim Biophys Acta, 1996, 1278(1): 41-50.

[10] ZHAO Y N, QURESHI F, ZHANG S B, et al. Novel gemini cationic lipids with carbamate groups for gene delivery [J]. Journal of Material Chemistry B, 2014, 2: 2920-2928.

[11] ZHI D F, ZHANG S B, QURESHI F, et al. Structure-activity relationship of carbamate-linked cationic lipids bearing hydroxyethyl headgroup for gene delivery [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 112(1): 537-541.

[12] HEURTAULT B, SAULNIER P, PECH B, et al. Physico-chemical stability of colloidal lipid particles[J]. Biomaterials, 2003, 24(23): 4283-4300.

[13] ZUHORN I S, BAKOWSKY U, POLUSHKIN E, et al. Nonbilayerphase of lipoplexes membranemixture determines endosomal escape of genetic cargo and transfection efficiency [J]. Molecular Therapy, 2005, 11(5): 801-810.

[14] GAO X, HUANG L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammaliam cells [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1991, 179(1): 280-285.

[15] METWALLY A A, BLAGBROUGH I S, MANTELLJ M. Quantitative silencing of EGFP reporter gene by self-assembled siRNA lipoplexes of LinOS and cholesterol [J]. American Chemical Society, 2012, 9(11): 3384-3395.

[16] ZHI D F, ZHANG S B, QURESHI F, et al. Synthesis and biological activity of carbamate-linked cationic lipids for gene deliveryinvitro[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22: 3837-3841.

(責(zé)任編輯 趙環(huán)宇)

Study on Stability of Cationic Liposomes Gene Carriers

ZHAO Yi-nan, LIU An, FU Ying, ZHANG Shu-biao

(SEAC-ME Key Laboratory of Biotechnology and Bio-resources Utilization, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

The stability of liposome CPA14 was studied by examining the size, morphology, Zeta potentials and turbidity. The TEM showed the particle sizes of liposomes which is of spherical structure were 100～200 nm, and the dynamic light scattering showed the particle size of cationic liposomes were from 210 to 260 nm, which were distributed uniformly. Zeta potentials of the liposomes were between 55～90 mV. The appearance of liposomes did not change significantly at 4 ℃ for 3 months. The turbidity of liposomes remained unchanged in three months. It was confirmed that the quaternary ammonium cationic liposome CPA14 had good stability and was suitable for gene transfer.Invitrotransfection of the liposomes was evaluated by using pGFP-N2 plasmid DNA against Hela cells. The results indicated that they had nearly the same transfection to the reagent DOTAP at the N:P ratio of 3:1. The results provide a theoretical basis for the construction of a novel quaternary ammonium cationic liposome gene carriers.

cationic liposomes; particle sizes; Zeta potentials; turbidity; transfection efficiency

2017-03-27；最后

2017-04-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21176046，21606041), 國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2014AA020707)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC201501076)。

趙軼男(1979-), 女, 遼寧撫順人, 高級(jí)工程師, 博士，主要從事基因載體及其輸送技術(shù)研究。

張樹彪(1971-), 男, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事基因載體及其遞送技術(shù)研究，E-mail:zsb@dlnu.edu.cn。

2096-1383(2017)03-0202-05

R941

A