陳正毅，盧雅琳，梁 豫，曾 晨，張卓旻，李攻科

(中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275)

表面增強拉曼光譜法快速測定干果類食品中的糖精鈉

陳正毅，盧雅琳，梁 豫，曾 晨，張卓旻*，李攻科*

(中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275)

建立了干果中糖精鈉的表面增強拉曼光譜(SERS)快速分析方法。干果樣品經水提取、C18固相萃取柱凈化除雜后進行表面增強拉曼光譜分析。該方法的線性范圍為 50.0～250 mg/L，檢出限為 0.6 g/kg，回收率為80.0%～125%，相對標準偏差(RSD，n=5)不大于8.4% 。結果表明該方法靈敏度高、雜質干擾小、準確度高，滿足干果類食品中糖精鈉的快速檢測要求，在干果類食品安全質量監(jiān)控方面具有良好的應用潛力。

表面增強拉曼光譜法；快速分析；糖精鈉；干果

糖精鈉俗稱甜精、糖精，是一種常見的人工合成甜味劑。由于糖精鈉的甜度比蔗糖、紅糖等天然甜味劑甜300～600倍[1]，被廣泛添加于各類干果類食品。相關研究表明，糖精鈉具有潛在的致癌效應[2-3]，影響未成年人健康[1-2]，因此許多國家對干果類食品中糖精鈉的用量有嚴格規(guī)定，如歐盟對其限量為0.5～3.0 g/kg[4]，中國國標(GB 2760-2014)對其限量為1.0～5.0 g/kg[5]。目前，為了獲得更好的口感和消費者認可度，許多市售干果類產品經常被過量添加糖精鈉，因此干果類產品中糖精鈉含量的快速分析對干果類產品質量監(jiān)控具有重要意義。

目前，糖精鈉的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS)[6]、薄層色譜法[7]、紫外分光光度法[8]、比色法[9]、電化學法[10]、酶聯(lián)免疫法[11]等。其中，HPLC法是國家標準(GB/T 5009.28-2003)采用的分析方法[12]，但操作復雜、分析耗時長，不利于大量樣品的現(xiàn)場快速檢測。酚磺鈦比色法和紫外分光光度法曾是糖精鈉的快速篩查國標方法[13]，但因其樣品提取和分離過程復雜，易受食品基體成分干擾，而最終被HPLC法取代。因此，目前尚無準確有效的干果類產品中糖精鈉的現(xiàn)場快速分析方法。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)具有快速、靈敏及指紋特征分析等特點，由于便攜SERS儀器尺寸小，非常適合于現(xiàn)場快速分析，現(xiàn)已廣泛用于食品添加劑[14]、著色劑[15]和抗生素[16]等的快速分析。但實際樣品基體復雜，嚴重影響了SERS定性定量分析的準確性，而將適當的樣品前處理方法與SERS分析結合，能有效提高SERS分析的準確性。田中群課題組[17]研發(fā)出的殼層隔絕納米粒子(Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy，SHINERS)避免了基體或者目標物與Au產生的電化學作用，獲得了準確的待測物SERS光譜，提高了SERS定性的準確度[18]，已應用于食物中農藥殘留[19]、添加劑[20]等的檢測。李攻科課題組[21]建立了一種固相萃取/SERS快速檢測牛奶中三聚氰胺的方法，有效去除了牛奶基體干擾，檢出限達0.1 mg/kg，回收率達75.3%～125%。本文旨在建立一種適用于干果類食品中糖精鈉快速分析的SERS方法。通過優(yōu)化超聲提取、離心時間、固相萃取及SERS分析條件，消除基體干擾，最終實現(xiàn)了干果中糖精鈉的SERS快速分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Delta Nu Inspector便攜式拉曼光譜儀(美國Delta Nu)；TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；MIULAB微型離心機(杭州米歐儀器有限公司)。

高級純糖精鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；SERS增強試劑CP-2(SHINERS，廈門市普識納米科技有限公司)；鹽酸(分析純，廣州化學試劑廠)；活性碳粉、氧化鋁(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；硅膠(分析純，煙臺黃務硅膠開發(fā)試驗廠)；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18，上海博勢生物科技有限公司)；無花果、話梅等樣品購自廣州市當地超市。

糖精鈉標準溶液的配制：用超純水配制濃度為5 000 mg/L 的糖精鈉標準儲備液，將儲備液逐級稀釋成50.0，100，150，200，250 mg/L 的系列濃度標準溶液。

1.2 樣品測定

將無花果、話梅、橄欖干樣品剪碎并搗勻，稱取2.0 g 樣品，加入10.0 mL水，300 W下超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min；將100 μL上清液轉移至含有0.10 g C18的固相小柱中，加2.0 mL水，接收濾液，待測。移取200 μL SERS增強試劑CP-2于拉曼管中，加入100 μL待測液和10 μL 1.2 mol/L鹽酸溶液，混勻后進行SERS檢測。SERS條件：積分時間為20 s，測定次數為3，每次測試扣除暗電流背景1次，激光功率為High，結果為Average，分辨率為Low。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件 采用超聲提取樣品中的糖精鈉，優(yōu)化了超聲時間和離心時間，實現(xiàn)了干果中糖精鈉的快速提取，結果如圖1A所示。在300 W超聲功率下，對比了超聲時間分別為4，6，8，10，12，14，16 min時的提取結果，結果表明，提取時間為12 min時目標峰的SERS信號開始穩(wěn)定。在8 000 r/min離心條件下，對比離心時間分別為1，3，5，7，9 min時的提取結果，結果表明，離心5 min時目標峰的SERS響應最強。離心時間過短導致雜質沉淀不完全，影響后續(xù)SERS測定，所以提取階段超聲時間設為12 min，離心時間設為5 min。

2.1.2 固相萃取條件 由于糖精鈉既包含疏水的苯環(huán)結構，又包含親水的磺胺結構，不同萃取劑的吸附性能對糖精鈉的分離富集效果不同。實驗分別考察了活性碳、硅膠、氧化鋁、C18作為固相萃取吸附劑對糖精鈉分離富集效果的影響。結果表明，活性碳、C18對糖精鈉的分離富集效果良好，但活性碳吸附的糖精鈉難以洗脫，硅膠、氧化鋁吸附劑易產生穿透現(xiàn)象，因此實驗采用C18作為吸附劑。實驗考察了不同C18吸附劑用量(0.02，0.05，0.10 g)對糖精鈉SERS檢測信號的影響，結果表明采用0.10 g C18吸附劑時，糖精鈉的SERS信號最強。實驗還考察了不同洗脫液體積(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL)對糖精鈉洗脫效果的影響，結果如圖1B所示，當洗脫液體積2.0 mL時可將糖精鈉完全洗出。

2.2 SERS分析條件的優(yōu)化

2.2.1 鹽酸用量 向待測溶液中添加鹽酸，可使SHINERS粒子表面帶正電，從而改善SHINERS粒子對糖精鈉的吸附選擇性，有效提高方法的靈敏度。實驗對比了鹽酸加入量為2，4，6，8，10，12，14，16 μL 的SERS信號，結果如圖1C所示。當HCl用量少于10 μL時，隨著HCl 加入量的增加，SERS信號增強，HCl用量為10 μL時峰信號最強；繼續(xù)加入HCl，SERS信號反而減弱。這可能是因為過多的鹽酸導致帶負電的糖精離子與H+結合，形成分子態(tài)的糖精，帶正電荷SHINERS對其吸附量降低，從而導致SERS信號減弱。糖精鈉在～710 cm-1處有明顯SERS響應，且峰強度隨濃度的增加而增大，是由SHINERS粒子與糖精鈉中帶負電的氨基連接所形成的磺胺環(huán)結構的呼吸振動引起[22-23]，這也證實了H+可以促進SHINERS對糖精鈉的吸附選擇性，提高SERS響應。因此，最終選擇HCl的加入量為 10 μL。

2.2.2 SHINERS粒子與樣品體積比的優(yōu)化 為獲得最佳SERS信號，優(yōu)化了SHINERS粒子與樣品溶液體積比。在總加入體積保持一致條件下，考察了SHINERS粒子與樣品溶液的體積比分別為1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1時糖精鈉的SERS特征峰響應，結果如圖1D所示。隨著體積比的增加，SERS響應逐漸增加，當比例為2∶1時SERS響應最強，繼續(xù)增加體積比反而使SERS響應降低。這是因為SHINERS粒子過少時，導致提供的熱點少而使得SERS響應弱，而SHINERS粒子過多時，由于熱點過剩導致SERS的響應減弱。因此，最終選擇SHINERS粒子與樣品溶液的體積比為2∶1。

圖2 糖精鈉標準溶液的SERS譜圖Fig.2 SERS spectra of saccharin sodium salt standard solution spectra(a-e) refer to standard solutions with concentrations of 50.0,100,150,200,250 mg/L，respectively； insert:calibration curve

圖3 實際樣品中糖精鈉的SERS圖譜Fig.3 SERS spectra of saccharin sodium salt in real samples spectra(a-d) refer to plum candy,Chinese olive,Ficus carica and 250 mg/L of standard solutions,respectively

2.3 方法選擇性的研究

通過考察干果類食品中雜質對糖精鈉SERS分析的干擾，研究了方法的選擇性。以～710 cm-1峰強度變化為評價標準，若加入干擾物后峰強無明顯變化，則視為不干擾。實驗考察了干果類食品中的主要基體物質(包括蔗糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、NaCl、維生素C等)對糖精鈉SERS分析的干擾影響。其中，最大的干擾來自于防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，因為其電離出的酸根可以吸附在SHINERS粒子表面，從而影響糖精鈉的SERS測定。但苯甲酸鈉(pKa=4.2)和山梨酸鉀(pKa=4.8)[24]與H+的結合能力比糖精鈉(pKa=2.1)[25]強，說明在優(yōu)化的酸度條件下(pH=3.0，實測)，糖精負離子的分布系數比苯甲酸根和山梨酸根大，故大部分糖精負離子可以吸附在帶正電的SHINERS粒子表面，可能存在的雜質對糖精鈉的測定影響可以忽略。此外，同一酸度條件下，由于分子態(tài)的苯甲酸和山梨酸在溶液中的分布系數比分子態(tài)的糖精大，所以大部分苯甲酸和山梨酸被C18吸附，從而可排除雜質干擾。實驗結果顯示，當蔗糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、NaCl、維生素C濃度為糖精鈉濃度的50倍時，糖精鈉的SERS譜圖中710 cm-1處的特征峰面積無明顯變化，表明干果食品基體物質不干擾糖精鈉的SERS分析，方法的選擇性滿足實際樣品分析要求。

2.4 SERS 快速分析方法的建立

配制濃度分別為 50.0，100，150，200，250 mg/L的系列糖精鈉標準溶液，在優(yōu)化條件下以～710 cm-1處特征峰峰面積(Y)對應標準溶液濃度(X,mg/L)繪制標準曲線(見圖2)。結果表明，糖精鈉在50.0～250 mg/L濃度范圍內具有良好的線性關系，方法的工作曲線為Y=51.3X+179.1(r2=0.987 9)，相對標準偏差(RSD)為6.5%，檢出限(S/N=3)為0.6 g/kg，定量下限(S/N=10)為2 g/kg。方法的靈敏度滿足國標方法(GB 2760-2014)中干果類食品中糖精鈉限量(5 g/kg)的檢測要求。

2.5 實際樣品分析

將該方法用于隨機購買的3種干果類食品(無花果、話梅、橄欖干)中糖精鈉的快速分析，結果表明無花果、話梅、橄欖干中的糖精鈉均可定量檢出(圖3)，其含量分別為3.1,1.5,2.2 g/kg(表1)。3種實際樣品均作加標回收實驗，分別取5份平行樣，加標量均為1.0,2.0,4.0 g/kg。加標回收實驗結果表明方法的回收率為80.0%～125%，RSD(n=5)為1.3%～9.3%，與HPLC標準方法獲得的結果比值在0.85～1.12之間，表明該方法準確可靠，可滿足干果類食品中糖精鈉的快速分析要求。

表1 實際樣品分析及加標回收實驗結果Table 1 Rapid analysis of saccharin sodium salt in real samples and recoveries from spiked experiments

*relative error referred to the difference of determination results achieved by SERS and HPLC

3 結 論

本文結合超聲提取及固相萃取等前處理方法，建立了干果食品中糖精鈉的SERS快速分析方法。系統(tǒng)優(yōu)化了超聲提取條件、固相萃取條件及SERS分析條件，有效消除了基體干擾，提高了方法的選擇性和靈敏度。在優(yōu)化實驗條件下，該方法的線性范圍為50.0～250 mg/L，檢出限為0.6 g/kg，RSD(n=5)為6.5%。將該方法用于實際樣品分析，檢出無花果、話梅、橄欖干中的糖精鈉含量分別為3.1，1.5，2.2 g/kg，回收率為80.0%～125%，與HPLC標準方法的相對偏差為-17%～10%，結果表明該方法準確可靠，可用于實際干果類食品中糖精鈉的現(xiàn)場快速分析。

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Rapid Analysis of Saccharin Sodium Salt in Dried Fruits by Surface-enhanced Raman Scattering Spectroscopy

CHEN Zheng-yi,LU Ya-lin,LIANG Yu,ZENG Chen,ZHANG Zhuo-min*,LI Gong-ke*

(School of Chemistry,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China )

A rapid analytical method was developed for the determination of saccharin sodium salt in dry fruits by surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS).The saccharin in real samples was extracted with water, followed being separated and cleaned up on the activated C18solid phase extraction column before surface-enhanced Raman scattering measurement.The linear range of this method was from 50.0 mg/L to 250 mg/L,and the detection limit was 0.6 g/kg.The good recoveries were in range of 80.0%-125% with relative standard deviations(RSD,n=5) no more than 8.4%.The results suggested that this method, with good anti-interference capability, was sensitive and reliable in the rapid determinattion of saccharin sodium salt in dry fruits.It is expected that this SERS based rapid analytical method possesses a great potential in monitoring the quality of dry fruits.

SERS；rapid analysis；saccharin sodium salt；dry fruits

2016-12-12；

2017-01-20

國家自然科學基金(21275168，21475154，21475153)；國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2011YQ0301240901)；廣東省自然科學基金(2015A030311020)；廣東省公益研究與能力建設專項(2015A030401036)；廣州市民生科技重大專項(201604020165)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.012

O657.37；O629.1

A

1004-4957(2017)05-0650-05

*通訊作者：張卓旻，博士，副教授，研究方向：食品安全分析，Tel：020-84110922，E-mail：zzm@mail.sysu.edu.cn 李攻科,博士，教授，研究方向：色譜光譜分析、復雜體系分離分析，Tel：020-84110922，E-mail：cesgkl@mail.sysu.edu.cn