盧穎，馬艷萍，柳中洋，王鴻雁，齊瑩，韓麗英，高爽，鄭博，劉暢，黃郁晶，阮強

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽110004；2.錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧錦州121000；3.沈陽市婦嬰醫(yī)院臨床實驗室，沈陽110014；4.沈陽市婦嬰醫(yī)院兒科，沈陽110014）

人巨細胞病毒Han株US12基因缺失株的構(gòu)建及其在人胚肺成纖維細胞中的復制

盧穎1，2，馬艷萍1，柳中洋1，王鴻雁1，齊瑩1，韓麗英1，高爽3，鄭博4，劉暢1，黃郁晶1，阮強1

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽110004；2.錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧錦州121000；3.沈陽市婦嬰醫(yī)院臨床實驗室，沈陽110014；4.沈陽市婦嬰醫(yī)院兒科，沈陽110014）

目的構(gòu)建人巨細胞病毒（HCMV）Han株US12基因缺失的BAC毒株，研究US12產(chǎn)物對HCMV Han株在人胚肺成纖維細胞（HELF）中復制的影響。方法以側(cè)翼含有US12基因同源序列的PCR引物擴增卡那霉素抗性基因，電轉(zhuǎn)至含有Han株BAC質(zhì)粒的大腸桿菌DY380-Han-wt-BAC，PCR及DNA測序驗證US12缺失的病毒序列。將缺失突變質(zhì)粒Han-ΔUS12-BAC-P電轉(zhuǎn)至HELF，獲得感染性病毒顆粒Han-ΔUS12-BAC。以MOI為0.1的Han-ΔUS12-BAC毒株及Han-wt-BAC毒株感染HELF，TCID50法測定上清中病毒滴度，繪制病毒增殖曲線。結(jié)果成功構(gòu)建了Han-ΔUS12-BAC克隆，轉(zhuǎn)染HELF后成功獲得感染性病毒。生長曲線實驗結(jié)果表明，ΔUS12缺失和野生型毒株在HELF中復制增殖與擴散水平無明顯差異。結(jié)論US12為HCMV臨床株Han在HELF中增殖和擴散過程中的非必需基因。

巨細胞病毒；US12；細菌人工染色體；生長曲線

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV） US12家族包括US12～US21共10個位置相鄰但彼此沒有重疊序列的開放讀碼框架，編碼產(chǎn)物與G蛋白耦聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族及抗凋亡蛋白Bax inhibitor 1家族具有結(jié)構(gòu)同源性［1］。該家族成員基因高度保守［2-3］，推測其具有重要的生物學作用，研究［4-10］證實它們參與自然殺傷細胞免疫逃逸，病毒裝配成熟與釋放，以感染細胞類型特異性的方式調(diào)控病毒增殖等。目前關于該家族成員US12生物學功能的研究很少，在HCMV感染人胚肺成纖維細胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）復制中發(fā)揮的作用也僅限于AD169［9］與Towne［11］等實驗室株，而US12是否影響HCMV臨床株感染HELF后的復制與擴散未見報道。

本研究室在2013年已成功構(gòu)建HCMV臨床株Han全基因組BAC克?。?2］并轉(zhuǎn)入大腸桿菌溶原菌株DY380［13］。為探討US12編碼產(chǎn)物在HCMV感染HELF過程中對病毒復制的影響，本研究利用DY380 λ缺陷噬菌體Red重組酶的同源重組特性，構(gòu)建Han-ΔUS12-BAC病毒株，并初步觀察了Han-ΔUS12-BAC株與Han-wt-BAC株在HELF中的復制與擴散水平。

1 材料與方法

1.1 材料

BAC體系相關實驗材料（BAC質(zhì)粒、E.coli DH10B、E.coliDY380、pGEM-oriV/Kan等）由美國新澤西醫(yī)科大學微生物與分子生物學系副研究員朱樺博士惠贈［13-14］。HCMV Han-wt-BAC克隆與病毒株為中科院武漢病毒所羅敏華教授課題組與中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室共同構(gòu)建［12］，BAC毒株以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達為病毒增殖指標。HELF由中國科學院武漢病毒學研究所羅敏華教授惠贈。

Nucleobond Xtra Midi DNA purification kit購自德國Macherey-Nagel公司；MEM、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等購自美國HyClone公司；DpnⅠ酶購自日本TaKaRa公司；Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System及Wizard?Plus SV Minipreps DNA Purification System購自美國Promega公司。

采用primer premier 5.0軟件設計US12缺失構(gòu)建及鑒定引物序列（表1，圖1）。

1.2 方法

1.2.1 感受態(tài)E.coliDY380-Han-wt-BAC的制備：取E.coliDY380-Han-wt-BAC甘油保存菌，接種于含氯霉素LB培養(yǎng)基中，32℃過夜振蕩培養(yǎng)。以1∶100比例將菌液加入新的氯霉素抗性LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，至OD600達到0.5～0.6。42℃水浴振搖15 min，立即轉(zhuǎn)移菌液到冰水混合物中，冰浴30 min。轉(zhuǎn)移菌液至預冷的離心瓶中，5 000g、4℃離心5 min。使用預冷的10%甘油洗滌沉淀，5 000g、4℃離心5 min，重復洗滌4次，使用1 mL 10%甘油重懸沉淀，分裝100 μL/支，-80℃保存。

表1 US12缺失構(gòu)建及鑒定引物序列Tab.1 Primers for US12 deletion construction and identification

圖1 實驗所用引物在US11-US13位點的位置Fig.1 Positions of primers in the US11-US13 locus

1.2.2 US12特異性Kan抗性基因片段的制備：以質(zhì)粒pGEM-oriV/Kan為模板，使用ΔUS12-kan-F和ΔUS12-kan-R引物擴增卡那霉素抗性基因片段。反應體系：ddH2O 27 μL，10×LA Taq buffer 5 μL，dNTP 8 μL，MgCl25 μL，ΔUS12-kan-F 1 μL，ΔUS12-kan-R 1 μL，LA Taq 1 μL，pGEM-oriV/Kan 2 μL，總反應體系50 μL。擴增條件：98℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2.5 min，30個循環(huán)；72℃10 min。DpnⅠ酶消化PCR產(chǎn)物以去除殘留模板質(zhì)粒。同時，設1組不加LA Taq的陰性對照組，其他成分及反應條件同PCR擴增組。使用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System Promega試劑盒從DpnⅠ酶切處理后的PCR擴增產(chǎn)物中切膠純化卡那霉素抗性片段。

1.2.3 Kan抗性片段電轉(zhuǎn)感受態(tài)E.coliDY380-Hanwt-BAC［15］：取5 μL純化的PCR產(chǎn)物與100 μL DY380-Han-wt-BAC感受態(tài)菌混勻，轉(zhuǎn)移到1 mm預冷的電轉(zhuǎn)杯中。同時電轉(zhuǎn)等體積的陰性對照組純化的PCR產(chǎn)物。應用BioRad電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化，參數(shù)設定為1.75 kV，25 μF，200 Ω，電擊時間為5 ms。電轉(zhuǎn)后，立即加入1 mL的預先平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管，32℃，225 r/min，培養(yǎng)1 h。4 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL LB培養(yǎng)基重懸，吹打混勻，涂布于卡那霉素與氯霉素抗性LB平板，32℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.4 Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒的PCR及測序鑒定：挑選單克隆菌，應用ΔUS12 R1和ΔUS12 F1引物進行菌落的PCR鑒定。挑取PCR鑒定為陽性的菌落接種于含有卡那霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)。采用Macherey-Nagel公司Nucleobond試劑盒，參考Plasmid DNA Purification User manual Nucleobond Xtra Midi步驟純化Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒。應用引物ΔUS12F1/ΔUS12R1與ΔUS12F2/ ΔUS12R2 PCR鑒定純化的質(zhì)粒，并采用引物ΔUS12F1/ΔUS12R1進行重組質(zhì)粒的DNA測序鑒定。

1.2.5 Han-ΔUS12-BAC毒株的獲得：取Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒5 μg、pp71質(zhì)粒［15］1 μg與HELF懸液混合于預冷的4 mm電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)化條件為電壓150 V，電容975 μF，電阻∞，電擊時間約為30～50 ms。電轉(zhuǎn)后，向電轉(zhuǎn)杯中加入MEM生長液1 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至T25 cm2培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)。直至出現(xiàn)GFP表達及HCMV特異性細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）。待CPE達到100%后，收集Han-ΔUS12-BAC毒株，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒滴度（TCID50）測定：按照2×104/孔將HELF接種于96孔板，培養(yǎng)至形成均勻致密細胞單層。用MEM維持液分別10倍稀釋Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC毒株，稀釋度為10-1～10-6。棄96孔板中培養(yǎng)液，由高稀釋度到低稀釋度的順序依次加入病毒懸液，每孔100 μL，每個病毒樣本每一稀釋度加入12孔，同時設正常細胞對照孔。在每次檢測中，同時進行完全相同的2塊培養(yǎng)板操作。37℃、5%CO2培養(yǎng)2周。接種病毒后7～14 d熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)每個稀釋度12個接種病毒孔中GFP陽性孔數(shù)量，按Reed-Muench兩氏法計算病毒滴度。

1.2.7 Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒在HELF中增殖：按照感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1將Han-ΔUS12-BAC病毒及Han-wt-BAC病毒分別接種于HELF，在接種后0、2、4、6、8、10、12 d收集培養(yǎng)物上清，采用TCID50法檢測其中病毒滴度。接種病毒后2 h為0 d時間點。以3次獨立的重復實驗結(jié)果（x±s）繪制生長曲線。

1.2.8 US12蛋白功能位點預測：應用Genedoc結(jié)合在線功能位點預測軟件ScanProsite，對US12蛋白功能位點進行預測。

2 結(jié)果

2.1 US12特異性Kan抗性基因片段的制備

應用ΔUS12-kan-F和ΔUS12-kan-R引物，以pGEM-oriV/Kan質(zhì)粒為模板PCR擴增卡那霉素抗性基因，檢測到約2 050 bp的擴增條帶（圖2）。

2.2 Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒的PCR及測序鑒定

將US12特異性Kan抗性基因片段電轉(zhuǎn)至DY380-Han-wt-BAC感受態(tài)菌，涂于卡那霉素與氯霉素抗性LB培養(yǎng)板后24～48 h，見若干菌落出現(xiàn)，而在不加LA-Taq進行擴增的陰性對照平板中未見菌落生長。

圖2 US12特異性Kan抗性基因片段的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of US12-specific Kan-resistant gene

將PCR鑒定為陽性的克隆菌落擴增培養(yǎng)，純化Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒。采用ΔUS12F1與ΔUS12R1引物PCR鑒定，結(jié)果見1條約2 050 bp的單一擴增帶，ΔUS12F2與ΔUS12R2引物鑒定未見擴增條帶，US13F與US13R引物鑒定見擴增條帶，與預期結(jié)果一致（圖3）。應用ΔUS12F1/US12R1對純化質(zhì)粒Han-ΔUS12-BAC-P進行測序鑒定，測序結(jié)果與預期結(jié)果一致，表明Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒中US12基因被Kan抗性基因替換，而臨近基因未受影響。

圖3 Han-ΔUS12-BAC-P純化質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of Han-ΔUS12-BAC-plasmid

2.3 Han-ΔUS12-BAC病毒的獲得

將Han-ΔUS12-BAC-P質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至HELF。培養(yǎng)約10～14 d后在普通倒置顯微鏡下可見HCMV典型CPE出現(xiàn)（圖4A、4C）；熒光顯微鏡觀察到病毒特異性GFP表達（圖4B、4D）。

2.4 Han-ΔUS12-BAC毒株生長曲線實驗

圖4 Han-ΔUS12-BAC-P電轉(zhuǎn)HELF 10 d及14 d后產(chǎn)生的病變效應及熒光結(jié)果Fig.4 Cytopathic effect and GFP expression in HELF after 10 and 14 days of electroporation with Han-ΔUS12-BAC-P

以MOI為0.1的Han-ΔUS12-BAC病毒和Han-wt-BAC病毒分別感染HELF，采用TCID50法檢測接種后0、2、4、6、8、10、12 d培養(yǎng)物上清中的病毒滴度繪制生長曲線。結(jié)果（圖5）顯示，在感染后的第4、6天Han-ΔUS12-BAC病毒效價略高于Han-wt-BAC病毒，而在8 d后兩者趨于相同。說明在HCMV臨床株Han感染HELF細胞過程中，US12基因?qū)τ诓《緩椭婆c擴散并非必不可少。

2.5 HCMV Han US12蛋白功能位點預測

應用Genedoc與ScanProsite對HCMV Han株 US12蛋白功能位點進行預測，結(jié)果表明，US12編碼產(chǎn)物預計有4個磷酸化位點，分別是位于31～34的cAMP與cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，位于37～40和232～235的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，以及位于42～44的蛋白激酶C磷酸化位點（圖6）。

3 討論

圖5 Han-ΔUS12-BAC與Han-wt-BAC毒株在HELF中的生長曲線（以3次獨立的重復實驗結(jié)果x±s繪制）Fig.5 Growth kinetics of Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC strains in HELF（values of the viral titer represent the average obtained from triplicate experiments）

圖6 HCMV Han US12蛋白功能位點預測Fig.6 Functional motifs prediction of HCMV Han US12

HCMV基因組約240 kb，病毒復制周期較長，部分成熟病毒顆粒滯留于感染細胞內(nèi)。對HCMV進行基因定點突變，傳統(tǒng)的RecA介導同源重組方法操作繁瑣耗時，效率低下，目前已逐漸被λ Red同源重組工程體系所代替。λ前噬菌體缺失部分為導致裂解性感染的cro至bioA基因區(qū)。PL啟動子調(diào)控的同源重組酶基因exo，beta，gam的表達受到溫度敏感λ抑制子（cI857）的嚴格控制。cI857在42℃下失活，使exo，beta，gam基因表達，可避免電轉(zhuǎn)至細胞內(nèi)的線性雙鏈DNA被RecBCD降解，并具有同源重組活性。相比基于Red質(zhì)粒的重組體系，具有表達穩(wěn)定、重組效率高的優(yōu)勢［16］。

BAC在克隆HCMV等長基因組病毒方面有明顯優(yōu)勢，不僅轉(zhuǎn)化效率高，且易于純化，也保障了病毒基因組序列在不斷增殖過程中保持穩(wěn)定［17］。本研究利用已經(jīng)成功構(gòu)建的Han-wt-BAC克?。?2］，成功獲得了US12缺失突變BAC病毒株。在進行突變株病毒拯救之前，對US12缺失BAC克隆進行測序確認。電轉(zhuǎn)化HELF 10～14 d后出現(xiàn)細胞病變效應及GFP表達，說明US12表達產(chǎn)物缺失并未影響病毒成熟與包裝。

HCMVUS12基因家族為保守基因區(qū)，是七次跨膜蛋白超家族的一個獨立分支家族。該家族僅在靈長類巨細胞病毒中存在，說明該家族成員為新近進化基因區(qū)。盡管HCMVUS12基因家族成員的結(jié)構(gòu)和序列與GPCR家族成員具有一定程度的同源性，迄今尚未確定US12家族成員與HCMV編碼的GPCR成員如US27、US28、UL33和UL78等，具有相同的功能。作為US12家族成員之一的US12基因，相關研究結(jié)果僅在關于HCMV轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組功能高通量分析中涉及。為了鑒定與HCMV潛伏感染建立相關的基因，CHEUNG等［18］在HCMV TownevarRIT3株感染原代人?！奘杉毎婕毎?～11 d檢測到37種病毒RNA，其中US12mRNA在潛伏感染建立的第1天表達，說明US12可能參與潛伏感染的建立。盡管HCMVUS12缺失對Towne株在HELF中復制并無影響［11］，但是HCMV低傳代臨床分離株US12基因在感染HELF及內(nèi)皮細胞、上皮細胞等其他容許宿主細胞中對于病毒復制及感染擴散的作用至今并無報道。

本研究中，低劑量Han-ΔUS12-BAC與Han-wt-BAC毒株感染HELF生長曲線結(jié)果表明，盡管Han-ΔUS12-BAC株在第4、6天的滴度略高于Han-wt-BAC，但8 d后2種病毒滴度趨于一致，Han-ΔUS12-BAC與Han-wt-BAC 2株病毒在HELF中復制擴散無明顯差異，表明US12對HCMV臨床分離株Han在HELF中的復制及病毒播散并非必不可少。US12基因在HCMV感染內(nèi)皮細胞及上皮細胞等其他細胞類型中對病毒復制的影響需要進一步研究。

目前，關于US12家族成員的研究，除了該家族基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的研究［19-20］和其編碼蛋白對病毒復制的影響以外，其表達產(chǎn)物在感染細胞中的定位也是研究熱點之一。DAS等［6-7］對US14，US17和US18表達蛋白在HELF內(nèi)的定位進行了研究，發(fā)現(xiàn)它們分布于感染細胞胞質(zhì)中高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、內(nèi)體溶酶體及病毒裝配復合體（virion assembly complex，vAC）的內(nèi)部或周邊。這些病毒蛋白在細胞內(nèi)的定位和分布具有感染時相依賴性。不同于該家族其它成員蛋白的定位特點，US17不僅分布于胞質(zhì)，還以病毒感染依賴的方式分布于細胞核的內(nèi)部。已證實存在于胞核內(nèi)的并非US17完整蛋白，而是其可溶性的羧基端片段［7］。BRONZINI等［8］利用BAC克隆構(gòu)建了US16 HA標記的重組HCMV病毒，在感染晚期階段檢測到US16聚集于胞質(zhì)中病毒裝配復合體。下一步US12編碼產(chǎn)物在HELF中定位的研究工作可為探索其功能提供線索。

基于生物信息學分析進行的US12蛋白功能預測也可為今后的研究提供方向。據(jù)報道，US12在第七跨膜區(qū)TM7與羧基端之間存在（S/T）xxx（W/F）基序［1］，這一基序與Wnt［21］受體Frizzled家族中的KTxxxW基序為同源序列，而該序列正是Frizzled受體與胞內(nèi)磷酸化蛋白Dishevelled相互作用的區(qū)域。位于US12第二胞漿環(huán)C2區(qū)的DYT基序同經(jīng)典GPCR與G蛋白結(jié)合的DRY基序相似，US12也可能參與GPCR介導的信號調(diào)節(jié)。結(jié)合本研究得到的US12編碼蛋白氨基端和羧基端存在磷酸化位點的預測結(jié)果，如US12蛋白確能與Dishevelled或G蛋白結(jié)合而參與Wnt等信號通路的調(diào)節(jié)，則預示著其可能在HCMV致病過程中發(fā)揮重要作用。關于US12相互作用蛋白的實驗研究對揭示其功能具有重要意義，有待進一步深入探討。

［1］LESNIEWSKI M，DAS S，SKOMOROVSKA-PROKVOLIT Y，et al. Primate cytomegalovirus US12 gene family：a distinct and diverse clade of seven-transmembrane proteins［J］.Virology，2006，354（2）：286-298.DOI：10.1016/j.virol.2006.06.035.

［2］MURPHY E，YU D，GRIMWOOD J，et al.Coding potential of laboratory and clinical strains of human cytomegalovirus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（25）：14976-14981.DOI：10.1073/ pnas.2136652100.

［3］DOLAN A，CUNNINGHAM C，HECTOR RD，et al.Genetic content of wild-type human cytomegalovirus［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt5）：1301-1312.DOI：10.1099/vir.0.79888-0.

［4］FIELDING CA，AICHELER R，STANTON RJ，et al.Two novel human cytomegalovirus NK cell evasion functions target MICA for lysosomal degradation［J］.PLoS Pathog，2014，10（5）：e1004058. DOI：10.1371/journal.ppat.1004058.

［5］FIELDING CA，WEEKES MP，NOBRE LV，et al.Control of immune ligands by members of a cytomegalovirus gene expansion suppresses natural killer cell activation［J］.Elife，2017 Feb 10；6.pii：e22206.DOI：10.7554/eLife.22206.

［6］DAS S，PELLETT PE.Members of the HCMV US12 family of predicted heptaspanning membrane proteins have unique intracellular distributions，including association with the cytoplasmic virion assembly complex［J］.Virology，2007，361（2）：263-273.DOI：10.1016/j.virol.2006.11.019.

［7］DAS S，SKOMOROVSKA-PROKVOLIT Y，WANG FZ，et al.Infection-dependent nuclear localization of US17，a member of the US12 family of human cytomegalovirus-encoded seven-transmembrane proteins［J］.J Virol，2006，80（3）：1191-1203.DOI：10.1128/ JVI.80.3.1191-1203.2006.

［8］BRONZINI M，LUGANINI A，DELL’OSTE V，et al.The US16 gene of human cytomegalovirus is required for efficient viral infection of endothelial and epithelial cells［J］.J Virol，2012，86（12）：6875-6888.DOI：10.1128/JVI.06310-11.

［9］YU D，SILVA MC，SHENK T.Functional map of human cytomegalovirus AD169 defined by global mutational analysis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（21）：12396-12401.DOI：10.1073/ pnas.1635160100.

［10］CAVALETTO N，LUGANINI A，GRIBAUDO G，et al.Inactivation of the Human cytomegalovirus US20 gene hampers productive viral replication in endothelial cells［J］.J Virol，2015，89（21）：11092-11106.DOI：10.1128/JVI.01141-15.

［11］DUNN W，CHOU C，LI H，et al.Functional profiling of a human cytomegalovirus genome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（24）：14223-14228.DOI：10.1073/pnas.2334032100.

［12］ZHAO F，SHEN ZZ，LIU ZY，et al.Identification and BAC construction of Han，the first characterized HCMV clinical strain in China［J］.J Med Virol，2016，88（5）：859-870.DOI：10.1002/ jmv.24396.

［13］LEE EC，YU D，MARTINEZ DE VELASCO J，et al.A highly efficientEscherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA［J］.Genomics，2001，73（1）：56-65.DOI：10.1006/geno.2000. 6451.

［14］DUNN W，CHOU C，LI H，et al.Functional profiling of a human cytomegalovirus genome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（24）：14223-14228.DOI：10.1073/pnas.2334032100.

［15］SAMBROOK JF，RUSSEL DW.Molecular cloning：a laboratory manual［M］.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000：284-286.

［16］NARAYANAN K，WILLIAMSON R，ZHANG Y，et al.Efficient and precise engineering of a 200 kb beta-globin human/bacterial artificial chromosome in E.coli DH10B using an inducible homologous recombination system［J］.Gene Ther，1999，6（3）：442-447. DOI：10.1038/sj.gt.3300901.

［17］MURRELL I，WILKIE GS，DAVISON AJ，et al.Genetic stability of bacterial artificial chromosome-derived human cytomegalovirus during culture in vitro［J］.J Virol，2016，90（8）：3929-3943. DOI：10.1128/JVI.02858-15.

［18］CHEUNG AK，ABENDROTH A，CUNNINGHAM AL，et al.Viral gene expression during the establishment of human cytomegalovirus latent infection in myeloid progenitor cells［J］.Blood，2006，108（12）：3691-3699.DOI：10.1182/blood-2005-12-026682.

［19］GUO YW，HUANG ES.Characterization of a structurally tricistronic gene of human cytomegalovirus composed of U（s）18，U（s）19，and U（s）20［J］.J Virol，1993，67（4）：2043-2054.

［20］LU Y，MA Y，LIU Z，et al.A cluster of 3’coterminal transcripts from US12-US17 locus of human cytomegalovirus［J］.Virus Genes，2016，52（3）：334-345.DOI：10.1007/s11262-016-1308-z.

［21］CLEVERS H.Axin and hepatocellular carcinomas［J］.Nat Genet，2000，24（3）：206-208.DOI：10.1038/73396.

（編輯 王又冬）

Construction of Human Cytomegalovirus Han-ΔUS12-BAC Strain and Studies on Its Replication in Human Embryonic Lung Fibroblasts

LU Ying1，2，MA Yanping1，LIU Zhongyang1，WANG Hongyan1，QI Ying1，HAN Liying1，GAO Shuang3，ZHENG Bo4，LIU Chang1，HUANG Yujing1，RUAN Qiang1

（1.Virus Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pathogen Biology，College of Basic Medical Sciences，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China；3.The Clinical Laboratory，Shenyang Women’s and Children’s Hospital，Shenyang 110014，China；4.The Pediatric Department，Shenyang Women’s and Children’s Hospital，Shenyang 110014，China）

Objective To construct human cytomegalovirus（HCMV）Han-ΔUS12-BAC strain and to study the role of US12 in HCMV replication in human embryonic lung fibroblasts（HELF）.MethodsKanamycin-resistant gene was amplified with primers containing homology arms sequence flankingUS12and then electroporated intoE.coliDY380-Han-wt-BAC competent cells.Successfully recombinant Han-ΔUS12-BAC clones were identified by PCR，sequenced for confirmation Han-ΔUS12-BAC plasmids were electroporated into HELF to produce infectious virions.Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC were inoculated onto HELF at the multiplicity of infection of 0.1 pfu/cell.The viral titer in the supernatant was measured by TCID50 assay and growth kinetics of the viruses in HELF was studied.ResultsHan-ΔUS12-BAC clone was successfully constructed.Han-ΔUS12-BAC was reconstructed in HELF to generate infectious virions.Growth kinetics assay indicated that Han-ΔUS12-BAC and Han-wt-BAC showed no differences in their growth and dissemination in HELF.ConclusionUS12in HCMV clinical strain Han is dispensable for HCMV growth and dissemination in HELF.

cytomegalovirus；US12；bacterial artificial chromosome；growth kinetics

R373.9

A

0258-4646（2017）06-0489-07

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.003

國家自然科學基金（30672248，81371788）；盛京醫(yī)院自由研究者項目

盧穎（1971-），女，副教授，博士.

阮強，E-mail：ruanq@sj-hospital.org

2016-09-13

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