解世林，曲晶磊，范一博，車曉芳，侯科佐，曲秀娟，劉云鵬，王曉楠，康健，胡雪君

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.呼吸疾病研究所呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng)110001）

·論著·

Akt和SRC在Exosomes促進(jìn)同源肺癌細(xì)胞增殖中的作用

解世林1，曲晶磊2，范一博2，車曉芳2，侯科佐2，曲秀娟2，劉云鵬2，王曉楠1，康健3，胡雪君1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.呼吸疾病研究所呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng)110001）

目的探索肺癌細(xì)胞分泌的Exosomes對(duì)其分泌細(xì)胞及其同源腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以及PI3K/Akt和SRC信號(hào)通路在其中的作用。方法采用密度梯度離心法從肺癌A549細(xì)胞的上清液中提取Exosomes，透射電子顯微鏡法觀察Exosomes的形態(tài)，Western blotting法檢測(cè)Exosomes標(biāo)志蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes的直徑在30～100 nm之間，由雙層膜構(gòu)成。Western blotting檢測(cè)到Exosomes中CD9的表達(dá)，且A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes以劑量和時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)其自身及同源腫瘤細(xì)胞HCC827細(xì)胞的增殖，并伴隨Akt和SRC的活化。結(jié)論肺癌A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes以時(shí)間和劑量依賴性促進(jìn)其自身及同源腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與Akt和SRC的活化有關(guān)。

Exosomes；增殖；肺癌；Akt；SRC

腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Exosomes是由腫瘤細(xì)胞分泌至胞外的小囊泡。腫瘤細(xì)胞分泌的Exosomes攜帶許多與其功能相關(guān)的蛋白質(zhì)及核酸［1］。有研究［2］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的Exosomes能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，Exosomes能否影響其分泌細(xì)胞及同源腫瘤細(xì)胞的增殖能力及其機(jī)制尚不清楚。本研究探討了人肺腺癌細(xì)胞A549分泌的Exosomes對(duì)自身及同源腫瘤細(xì)胞HCC827增殖能力的影響，以及PI3K/Akt和SRC通路在其過(guò)程中的作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究肺癌來(lái)源的Exosomes對(duì)腫瘤細(xì)胞調(diào)控增殖的機(jī)制提供了新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和HCC827購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。A549、HCC827細(xì)胞生長(zhǎng)于含有12 U/L慶大霉素、10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 Exosomes的制備

收集培養(yǎng)48 h后的肺癌A549細(xì)胞上清液，用于提取Exosomes。首先，收集的細(xì)胞上清液，在4℃條件下，通過(guò)300g5 min、2 000g20 min、10 000g70 min等步驟離心，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。然后，將上清液移入高速離心管中，100 000g120 min。離心管中加滿PBS溶液，再次4℃100 000g120 min離心。得到提純的Exosomes沉淀。PBS 450 μL重懸，0.22 μm濾膜除菌，Bardford法測(cè)定蛋白含量，分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電鏡

Exosomes超速離心成的沉淀，于4℃經(jīng)固定液（2%多聚甲醛，2.5%戊二醛）固定1 h，PBS洗滌后，再經(jīng)l%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋。最后超薄切片、鉛鈾染色，于透射電子顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

會(huì)務(wù)組聯(lián)系方式：0351-4557677；4557096；4557076；4557660；4084788(傳真)；(0)18636869413；(0)15935617064；quanguomhg@126.com；mhgqk@126.com；lhg66625@126.com。

提取A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes，經(jīng)超聲破碎后加入上樣緩沖液，煮沸5 min。不同濃度的（0 μg/mL、5 μg/mL和20 μg/mL）Exosomes作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞48 h后，同時(shí)收集各組的A549細(xì)胞，將其裂解，與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將Exosomes樣品和A549細(xì)胞裂解物進(jìn)行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗，4℃過(guò)夜，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育30 min，ECL法顯色，圖像分析并處理。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549或HCC827細(xì)胞胰酶消化，以0.45×104/孔或0.55×104/孔的細(xì)胞接種于96孔板，分別加入終濃度為5和20 μg/mL的A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes。設(shè)置空白及正常對(duì)照組（空白組不加細(xì)胞，正常對(duì)照組不加Exosomes，其余均與Exosomes實(shí)驗(yàn)組同樣處理）。分別培養(yǎng)48 h和72 h后每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩搖勻后，于570 nm波長(zhǎng)下記錄吸光度值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率（%）=（處理組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對(duì)照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以x±s表示。2組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 提取A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes

透射電子顯微鏡下觀察，肺癌A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes為雙層膜的圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑30～100 nm（圖1A）。利用Western blotting檢測(cè)Exosomes與等量的A549細(xì)胞裂解物相比，蛋白表達(dá)的差異。Western blotting結(jié)果顯示，Exosomes富含外泌體標(biāo)志性蛋白CD9（圖1B）。

圖1 肺腺癌A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes的驗(yàn)證×50 000Fig.1 Validation of Exosomes isolated from A549 lung adenocarcinoma cells×50 000

2.2 肺癌細(xì)胞A549來(lái)源的Exosomes促進(jìn)其分泌細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)Exosomes作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes作用于其自身48 h和72 h后，細(xì)胞的增殖能力以劑量和時(shí)間依賴的方式增強(qiáng)（P＜0.05），提示Exosomes可促進(jìn)其分泌細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖2。

圖2 A549來(lái)源的Exosomes促進(jìn)A549細(xì)胞增殖Fig.2 Plot depicting the proliferation of A549 cells using varying concentrations of Exosomes

2.3 A549來(lái)源的Exosomes促進(jìn)同源肺癌細(xì)胞HCC827的增殖

將5μg/mL、20μg/mL的Exosomes作用于HCC827細(xì)胞48 h及72 h后，MTT結(jié)果顯示HCC827細(xì)胞增殖能力以時(shí)間和劑量依賴的方式增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)果提示，A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes可促進(jìn)同源腫瘤細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖3。

圖3 A549來(lái)源的Exosomes促進(jìn)HCC827細(xì)胞增殖Fig.3 Plot depicting the proliferation of HCC827 cells using varying concentrations of Exosomes

2.4 Exosomes誘導(dǎo)其分泌細(xì)胞中Akt和SRC的活化

Western blotting法檢測(cè)5 μg/mL、20 μg/mL的Exosomes作用A549細(xì)胞24 h和48h后，Akt、SRC的表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，Exosomes作用于A549細(xì)胞后，phosph-Akt和phosph-SRC以時(shí)間和劑量依賴性的方式上調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖4 Exosomes處理A549細(xì)胞后對(duì)Akt、SRC活性的影響Fig.4 Activity of Akt and SRC after treatment of the A549 cells with the Exosomes

3 討論

Exosomes是由細(xì)胞主動(dòng)分泌至胞外的囊性小泡，攜帶其來(lái)源細(xì)胞的蛋白和核酸，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移等多種過(guò)程［3-5］。已有研究報(bào)道，肺癌來(lái)源的Exosomes能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。然而，其是否能促進(jìn)其分泌細(xì)胞自身和同源腫瘤細(xì)胞的增殖及其機(jī)制尚不明確。

Exosomes能通過(guò)自分泌及旁分泌方式影響腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)多種實(shí)體瘤細(xì)胞的增殖［2］。肺癌細(xì)胞分泌的ExosomalhTERT mRNA進(jìn)入纖維母細(xì)胞，促進(jìn)纖維母細(xì)胞增殖、延遲其衰老，改變了腫瘤微環(huán)境［6］。肺癌細(xì)胞中YKT6可通過(guò)促進(jìn)Exosomes的分泌，促進(jìn)肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移［7］。另有文獻(xiàn)［8］報(bào)道，肺癌細(xì)胞來(lái)源的Exosomal miR-302b可通過(guò)抑制TGFβRⅡ促進(jìn)肺癌的增殖與遷移。然而，肺癌來(lái)源的Exosomes是否可影響其分泌細(xì)胞及其同源腫瘤細(xì)胞的增殖尚不明確。本研究結(jié)果顯示，將A549細(xì)胞來(lái)源的Exosomes作用于其自身及同源腫瘤細(xì)胞HCC827后，2種細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，提示肺癌細(xì)胞來(lái)源的Exosomes可以促進(jìn)其分泌細(xì)胞及其同源腫瘤細(xì)胞的增殖。

近年研究［9-13］發(fā)現(xiàn)，Exoxomes能夠通過(guò)Akt或SRC信號(hào)的活化，促進(jìn)膀胱癌、胃癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究［14］顯示，肺癌細(xì)胞中GTPase促進(jìn)Exosomes的釋放且可激活A(yù)KT/GSK3β通路，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。然而Akt和SRC是否促進(jìn)其自身和同源腫瘤細(xì)胞的增殖尚不清楚。

在本研究中，A549細(xì)胞分泌的Exosomes通過(guò)誘導(dǎo)其自身細(xì)胞Akt和SRC的活化，促進(jìn)其增殖能力的增強(qiáng)，提示Akt和SRC是Exosomes促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要分子之一。

綜上所述，肺癌細(xì)胞來(lái)源的Exosomes既能促進(jìn)其分泌細(xì)胞增殖，亦能夠促進(jìn)同源腫瘤細(xì)胞的增殖。其機(jī)制可能與Akt和SRC信號(hào)的激活相關(guān)。本研究進(jìn)一步闡明了Exosomes促進(jìn)肺癌發(fā)展的機(jī)制，為治療肺癌提出了新的方向。

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（編輯 于溪）

Role of Akt and SRC Pathways in Exosome-mediated Proliferation of Homologous Lung Adenocarninoma Cells

XIE Shilin1，QU Jinglei2，F(xiàn)AN Yibo2，CHE Xiaofang2，HOU Kezuo2，QU Xiujuan2，LIU Yunpeng2，WANG Xiaonan1，KANG Jian3，HU Xuejun1

（1.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory and Infectious Disease of Geriatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Medical Oncology，Key Laboratory of Anticancer Drugs and Biotherapy of Liaoning Province，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To explore the effect of Exosomes isolated from the A549 lung cancer cells on the proliferation of these cells and their homologous tumor cells，HCC827，and the role of the PI3K/Akt and SRC signaling pathways in this process.MethodsExosomes were isolated from the supernatant after density gradient centrifugation of A549 cells.The Exosomes morphology was observed by transmission electron microscopy. The expression of the Exosome-specific proteins was analyzed using Western blotting.Cell proliferation was investigated using the MTT assay.ResultsThe A549-derived Exosomes were 30-100 nm in diameter and had a bilayer membrane.Western blotting showed that CD9 was detected in these Exosomes.The isolated Exosomes promoted the proliferation of the A549 and the HCC827 cells in a dose-and time-dependent manner，accompanied by the activation of Akt and SRC.ConclusionExosomes isolated from A549 cells promote the proliferation of the secreting cells and the homologous tumor cells in a dose-and time-dependent manner.The mechanism may be related to the activation of Akt and SRC.

Exosomes；lung cancer；proliferation；Akt；SRC

R734.2

A

0258-4646（2017）06-0481-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81372546，81472193）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2014226033，2014225013，L2014296）；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（LZ2014037）

解世林（1987-），女，助教，碩士.

胡雪君，E-mail：huxuejun2008@hotmail.com

2016-10-25

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：