王海光，姜華茂，左知潤，龍湟哲，袁觀遠(yuǎn)，賈凡振

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧錦州121001）

RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化在前列腺癌中的作用機(jī)制

王海光，姜華茂，左知潤，龍湟哲，袁觀遠(yuǎn)，賈凡振

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧錦州121001）

目的通過檢測RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變來闡明前列腺癌發(fā)生和演進(jìn)過程中RNF180表達(dá)的意義。方法分別采用Western blotting、RT-PCR、甲基化特異性PCR（MSP）及亞硫酸氫鹽測序（BSP）法檢測人前列腺癌細(xì)胞系（PC3、LNCap和DU145）與人正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）中RNF180的表達(dá)情況；采用免疫組化法檢測人前列腺癌組織芯片上前列腺癌及癌旁組織中RNF180蛋白的表達(dá)。結(jié)果前列腺癌細(xì)胞中RNF180基因的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯低于正常前列腺上皮細(xì)胞（P＜0.05），而前列腺癌細(xì)胞中RNF180啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平卻明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞；RNF180蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)量明顯低于相應(yīng)的癌旁組織。結(jié)論RNF180啟動(dòng)子區(qū)在前列腺癌細(xì)胞中呈高度非完全性甲基化狀態(tài)，這也可能是RNF180在癌細(xì)胞和癌組織中表達(dá)下降或沉默的原因之一。

前列腺癌；RNF180；啟動(dòng)子區(qū)甲基化

RNF180是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。研究［1-3］表明，胃癌組織中RNF180啟動(dòng)子甲基化頻繁，在總體生存率較差的胃癌患者中RNF180的表達(dá)降低或消失；RNF180基因在正常肝組織中未發(fā)生甲基化，而在肝細(xì)胞癌組甲基化率較肝硬化組高，提示RNF180啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化能促進(jìn)肝硬化到肝細(xì)胞癌的發(fā)展進(jìn)程，可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌形成的原因之一。目前關(guān)于前列腺癌中RNF180啟動(dòng)子的甲基化情況尚未見報(bào)道。因此，本研究擬通過多種檢測方法從多個(gè)層面研究RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變情況，并探討其與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞系（PC3、LNCap和DU145）與人正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）購自沈陽百思生物科技有限公司；前列腺癌組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司；RNF180一抗購自美國Sigma公司；全蛋白提取試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、兔抗體免疫組化（SP法）試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司；EZ DNA Methylation-Gold?Kit、Zy-moTaq?PreMix購自德國ZYMO RESEARCH公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購自日本Ta-KaRa公司；2×GreenstarTMqPCR Master Mix購自韓國BioNeer公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、換液、傳代、收集和凍存。

1.2.2 Western blotting：收集生長狀態(tài)良好的前列腺癌細(xì)胞系（PC3、LNCap和DU145）與正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1），提取蛋白，檢測濃度并定量。取上述蛋白制品（20 μL/孔）行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗室溫孵育2 h，加二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影，采用ScnImage軟件測量灰度值。

1.2.3 亞硫酸氫鹽測序PCR（bisulfite-sequeneing PCR，BSP）和甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）：收集細(xì)胞并提取DNA，按照EZ DNA Methylation-Gold?Kit試劑盒說明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾（引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件見表1～3）。行BSP，擴(kuò)增結(jié)束后從50 μL反應(yīng)體系中取10 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，若目的條帶清晰無雜帶，則對(duì)其余40 μL體系進(jìn)行DNA測序。行MSP，取20 μL反應(yīng)體系行2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察。

1.2.4 RT-PCR：收集細(xì)胞并提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR（引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件見表1～3）。擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL體系行2%瓊脂糖凝膠電泳。同時(shí)取上述cDNA制品行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系為2×GreenStarq PCR Master Mix 10 μL、上下游引物（100 μmol/L）各0.05 μL、DEPC水6 μL、cDNA樣本4 μL。

表1 引物設(shè)計(jì)序列Tab.1 Primer sequence

表2 PCR反應(yīng)體系Tab.2 PCR reaction system

表3 PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction conditions

1.2.5 免疫組化：前列腺癌組織芯片（表4）于60℃烤片10 min后，脫蠟及復(fù)水，采用EDTA法進(jìn)行抗原修復(fù)，于濕盒中30%H2O2室溫避光孵育15 min。按照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化（SP法）染色，蘇木精復(fù)染切片，用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水返藍(lán)，脫水透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間數(shù)值差異的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 前列腺癌組織芯片患者詳細(xì)信息Tab.4 The detailed information of prostate cancer patients

2 結(jié)果

2.1 Western blotting結(jié)果

RNF180蛋白在正常人前列腺上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，在人前列腺癌細(xì)胞PC3中的表達(dá)輕度下降，而在人前列腺癌細(xì)胞LNCap和DU145中的表達(dá)明顯下降（圖1）。

圖1 RNF180蛋白表達(dá)Western blotting檢測結(jié)果Fig.1 Western blotting results of RNF180 expression

2.2 BSP、MSP結(jié)果

根據(jù)BSP法結(jié)果計(jì)算RNF180啟動(dòng)子甲基化率，RWPE-1、PC3、LNCap、DU145分別為9.8%、31.7%、82.9%、85.4%（圖2）。提示正常前列腺上皮細(xì)胞中RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯低于前列腺癌細(xì)胞。MSP結(jié)果顯示，正常前列腺上皮細(xì)胞中RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯低于非甲基化水平，而LNCap和DU145的甲基化水平明顯高于非甲基化水平，PC3的甲基化水平則略低于非甲基化水平（圖3）。提示人前列腺癌細(xì)胞RNF180啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了非完全甲基化。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及BSP檢測結(jié)果Fig.2 PCR product and BSP results

圖3 RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化MSP檢測結(jié)果Fig.3 MSP results of RNF180 promoter methylation

2.3 RT-PCR結(jié)果

正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）中RNF180 mRNA的表達(dá)水平明顯高于前列腺癌細(xì)胞系（PC3、LNCap和DU145）（圖4）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果與上述結(jié)果基本一致（圖5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 RT-PCR檢測RNF180 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of RNF180 mRNA expression

圖5 熒光定量PCR檢測前列腺正常上皮細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞中RNF180基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The mRNA expression levels of RNF180 in normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells,as detected by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 免疫組化結(jié)果

在本研究的10例前列腺癌樣本中，RNF180蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)水平均明顯低于相應(yīng)的癌旁組織（圖6）。

3 討論

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤［4］。隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，過去10年中，我國前列腺癌粗發(fā)病率為2.98/10萬～17.69/10萬，總體呈增長趨勢(shì)［5］。隨著生物大規(guī)模分型技術(shù)的發(fā)展，DNA甲基化正在成為一類充滿希望的生物標(biāo)志物，DNA高甲基化狀態(tài)在惡性腫瘤中幾乎普遍存在［6～7］。RNF180是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物環(huán)指蛋白180是環(huán)指蛋白家族的一種新成員，參與包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展在內(nèi)的多種生物流程［8］。

圖6 前列腺癌及相應(yīng)癌旁組織中RNF180蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of RNF180 protein in prostate cancer and paired adjacent non-tumor tissues

研究［9～10］表明，前列腺癌組織中GSTP1和RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率均高于正常前列腺組織，提示GSTP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)。研究［11］證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌中，KEAP1基因由于啟動(dòng)子區(qū)高甲基化改變導(dǎo)致該基因呈低表達(dá)。CHEUNG等［1］和DENG等［2］的研究表明，RNF180在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，且啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變導(dǎo)致RNF180表達(dá)下降；UDALI等［12］的研究表明，RNF180啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化在酒精相關(guān)性肝癌的發(fā)展中起著重要作用。本研究檢測了前列腺癌細(xì)胞和組織中RNF180基因的表達(dá)情況，Western blotting、RT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示，RNF180基因在正常前列腺細(xì)胞及組織中的表達(dá)水平明顯高于前列腺癌細(xì)胞及組織，提示前列腺癌細(xì)胞及組織中表達(dá)異常的RNF180與異常的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有關(guān)。BSP和MSP結(jié)果顯示，正常前列腺細(xì)胞中RNF180啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度明顯低于前列腺癌細(xì)胞。表明前列腺癌細(xì)胞和組織中RNF180啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度與RNF180mRNA及蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這可能是RNF180在癌細(xì)胞和癌組織中表達(dá)水平下降或沉默的原因之一。

研究［13］證實(shí)，外周血與癌組織中RNF180甲基化的檢測結(jié)果一致；ZHANG等［14］的研究表明，外周血中RNF180與SFRP2的聯(lián)合檢測最適合于胃癌的診斷；臨床研究［15］證明，RNF180的甲基化檢測在臨床診療中可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子。由此可見，進(jìn)一步深入探討RNF180的作用機(jī)制，可能為臨床上腫瘤的診斷與治療提供新的方法和線索。

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（編輯 王又冬）

RNF180 Promoter Methylation in Prostate Cancer

WANG Haiguang，JIANG Huamao，ZUO Zhirun，LONG Huangzhe，YUAN Guanyuan，JIA Fanzhen

（Department of Urology，The First Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

Objective To clarify the significance of RNF180 expression in carcinogenesis and progression of prostate cancer by detection of RNF180promoter methylation.MethodsRNF180 expression was detected in human prostate cancer cell lines（PC3，LNCap，and DU145）and normal prostate cells（RWPE-1）via Western blotting，RT-PCR，methylation-specific PCR（MSP），bisulfite-sequeneing PCR（BSP），respectively，while RNF180 expression in human prostate cancer tissues and paired adjacent non-tumor tissue was detected via immunohistochemistry.ResultsThe expressions ofRNF180mRNA and protein in prostate cancer cells were significantly lower than those in normal prostate cells（P＜0.05），opposite to what was observed for the methylation level of theRNF180promoter.Additionally，the RNF180 expression in prostate cancer tissue was significantly lower than that in paired adjacent non-tumor tissue.ConclusionTheRNF180promoter is incompletely methylated in prostate cancer cells，which may be a reason for the decline or silencing ofRNF180expression in cancer cells and tissues.

prostate cancer；RNF180；methylation of promoter

R737.25

A

0258-4646（2017）06-0561-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.019

王海光（1990-），男，碩士研究生.

姜華茂，E-mail：lyyyjhm@163.com

2016-07-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：