佟周，劉長富，譚婧玉，王稚英

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，遼寧錦州121001）

姜黃素聯(lián)合順鉑對人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞的影響

佟周，劉長富，譚婧玉，王稚英

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，遼寧錦州121001）

目的姜黃素或姜黃素聯(lián)合順鉑在體外作用于人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞，觀察其對人舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響，并探討可能的抗腫瘤作用機(jī)制。方法將培養(yǎng)的Tca-8113細(xì)胞隨機(jī)分為姜黃素組、順鉑組、姜黃素聯(lián)合順鉑組和對照組。MTT法檢測各組藥物對舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞增殖的抑制作用；Hoechst 33258染色法觀察各組藥物對舌鱗癌細(xì)胞核的形態(tài)影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；Western blotting檢測各組藥物對舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞Notch1和表皮生長因子受體（EGFR）蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果MTT法結(jié)果顯示，姜黃素聯(lián)合順鉑組抑制舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞增殖的作用明顯高于姜黃素組和順鉑組（P＜0.05）。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，姜黃素聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞凋亡率明顯高于姜黃素組和順鉑組（P＜0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，與姜黃素聯(lián)合順鉑組比較，姜黃素組和順鉑組Notch1表達(dá)明顯上調(diào)，EGFR表達(dá)則明顯下調(diào)，而姜黃素聯(lián)合順鉑組對Notch1和EGFR表達(dá)調(diào)控的影響與姜黃素組和順鉑組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論姜黃素與順鉑在抑制人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞增殖時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)制可能與上調(diào)Notch1信號通路、下調(diào)EGFR信號通路有關(guān)。

姜黃素；順鉑；人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；信號通路

口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的3%，舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）在口腔癌中的構(gòu)成比最高，其發(fā)病率和死亡率在口腔頜面部惡性腫瘤中居首位［1］，尤其是TSCC晚期，腫瘤向肺部、縱膈等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常規(guī)的手術(shù)治療、放療、化療效果均不理想［2］。以順鉑為代表的鉑類化合物由于其顯著的抗腫瘤作用，是治療舌鱗狀細(xì)胞癌過程中最常用的一類化療藥物，其通過與DNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，發(fā)揮腫瘤殺傷作用。但順鉑具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其不良反應(yīng)以及耐藥性嚴(yán)重限制了該類藥物的使用［3］。

姜黃素是中藥姜黃的一種活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物等多方面的藥理作用。近年來，姜黃素抑制腫瘤增殖、促進(jìn)腫瘤凋亡的作用越來越引起人們的重視。已有研究［4］證實(shí)，姜黃素可以誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的凋亡，但姜黃素聯(lián)合順鉑是否具有協(xié)同作用尚不明確。本研究應(yīng)用姜黃素聯(lián)合順鉑作用于人舌鱗癌細(xì)胞，觀察是否可以增強(qiáng)二者單獨(dú)使用時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并結(jié)合相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化探討可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用化療藥物治療人舌鱗狀細(xì)胞癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（Tca-8113）購自中科院上海細(xì)胞生物研究所；姜黃素購美國Fluka公司；新生胎牛血清購自杭州四季青公司；順鉑購自齊魯制藥公司；MTT檢測試劑盒、Hoechst 33258、Annexin VFITC流式檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Sigma公司；一抗兔抗人Notch1多克隆抗體、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）多克隆抗體、鼠抗人βaction抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Tca-8113細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組：姜黃素組，用含終濃度為40 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；順鉑組，用含終濃度為4 μg/mL順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；姜黃素聯(lián)合順鉑組，用含終濃度為40 μmol/L姜黃素和4 μg/mL順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；對照組，RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

將Tca-8113細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，按照5×104/孔接種到96孔板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)板的邊緣孔加入等量無水PBS，設(shè)置空白對照孔。將96孔板置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，去除舊的培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組，每孔更換對應(yīng)培養(yǎng)液100 μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，各組細(xì)胞處理結(jié)束前4h每孔加入5mg/mL的MTT 10 μL，將孔內(nèi)培養(yǎng)上清液吸棄后，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定492 nm處的吸光值（A值）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-處理組A值/對照組A值）×100%［5］。

1.5 Hoechst 33258熒光染色法觀測細(xì)胞核形態(tài)變化

選取對數(shù)生長期的Tca-8113細(xì)胞接種于6孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照實(shí)驗(yàn)分組處理各組細(xì)胞48 h后，用PBS沖洗各孔3次，以4%多聚甲醛固定10 min，按照Hoechst 33258試劑盒的操作步驟進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照［6］。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將Tca-8113細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組處理各組細(xì)胞48 h后，用0.25%的胰酶消化并吹打制成單細(xì)胞懸液，4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次后，重懸細(xì)胞于250 μL結(jié)合緩沖液中，調(diào)節(jié)濃度至1×109/L，吸取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL碘化丙錠（20 μg/mL）溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400 μL PBS，上流式細(xì)胞儀分析［7］。

1.7 Western blotting檢測Notch1和EGFR表達(dá)情況

各組細(xì)胞處理結(jié)束后，用冰PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，然后加細(xì)胞裂解液并低溫放置20 min，再以12 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液進(jìn)行定量分析。取50 μg已定量的總蛋白進(jìn)行12%SDSPAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再用5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶500稀釋的一抗Notch 1、EGFR、β-action室溫孵育3 h，TBS溶液洗滌后加入1∶4 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h；TBS溶液再次洗滌后經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑孵育，發(fā)光，顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率

與對照組相比，姜黃素組和順鉑組的細(xì)胞生長抑制率均明顯升高（P＜0.05），而姜黃素聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞生長抑制率與順鉑組和姜黃素組相比明顯升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 Hoechst 33258熒光染色法觀測細(xì)胞核形態(tài)變化

熒光顯微鏡下可見對照組的細(xì)胞核邊緣光滑整齊，呈藍(lán)色；順鉑組和姜黃素組以及姜黃素聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞核固縮、邊緣不整齊，呈碎塊狀致密濃染，甚至可見裂解的細(xì)胞核，呈典型的凋亡特征性改變。見圖1。

表1 細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率和蛋白表達(dá)情況的比較Tab.1 Comparison of cell proliferation inhibition rate，apoptosis rate，and protein expression in different groups

圖1 Hoechst 33258熒光染色法觀測細(xì)胞核形態(tài)變化×200Fig.1 Morphological changes of the nucleus by Hoechst 33258 fluorescence staining×200

2.3 細(xì)胞凋亡率

與對照組相比，姜黃素組和順鉑組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），而姜黃素聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞凋亡率與姜黃素組和順鉑組相比明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖2。

2.4 Notch1和EGFR表達(dá)情況

與對照組相比，姜黃素組、順鉑組、姜黃素聯(lián)合順鉑組Notch 1蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01），而EGFR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），與姜黃素組、順鉑組相比，姜黃素聯(lián)合順鉑組Notch 1和EGFR的表達(dá)變化更為明顯（P＜0.01）。見表1、圖3。

3 討論

Notch信號通路由受體、配體和DNA結(jié)合蛋白組成，哺乳動(dòng)物中有4個(gè)Notch同源受體和5個(gè)同源配體，Notch 1受體是4個(gè)同源受體中的一種，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)組成，胞內(nèi)區(qū)包含一個(gè)N端RAM結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)將Notch信號轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)，胞外區(qū)有29～36個(gè)表皮生長因子樣重復(fù)序列，其中第11、12個(gè)表皮生長因子樣重復(fù)序列介導(dǎo)與配體的相互作用，Notch 1不僅對正常細(xì)胞分化起重要作用，而且與一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［9］，目前研究顯示，Notch 1在不同腫瘤乃至同一腫瘤中起著不同甚至相反的作用。有研究［10］表明，在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中，活化的Notch 1信號主要起增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用。本研究中流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素和順鉑相比，聯(lián)合應(yīng)用二者對Tca-8113細(xì)胞有更好的誘導(dǎo)凋亡作用，而Western blotting的結(jié)果提示，這可能是通過上調(diào)Notch 1蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率Fig.2 Cell apoptosis rate assayed by flow cytometry

圖3 Western blotting法檢測Notch1和EGFR的表達(dá)情況Fig.3 Detection of Notch1 and EGFR protein expression by Western blotting

EGFR屬跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，主要表達(dá)于基底層，維持角質(zhì)形成細(xì)胞的未分化狀態(tài)，其在基底層以上的細(xì)胞層中下調(diào)，EGFR信號通路在舌鱗狀癌等角質(zhì)形成來源的腫瘤中持續(xù)激活，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［11］。在姜黃素聯(lián)合順鉑作用Tca-8113細(xì)胞48 h后，細(xì)胞增殖抑制率顯著增加（P＜0.05），EGFR表達(dá)下調(diào)。說明姜黃素聯(lián)合順鉑的抗舌鱗狀細(xì)胞癌的作用很可能是通過調(diào)節(jié)Notch和EGFR 2條信號通路的活化水平來實(shí)現(xiàn)的。有研究指出，在皮膚癌中，Notch1是p53的靶基因，EGFR信號通路通過下調(diào)p53基因的轉(zhuǎn)錄而負(fù)向調(diào)控Notch 1基因的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖［12］。至于在人舌鱗癌細(xì)胞中Notch 1和EGFR之間是否存在交互作用，以及具體的相互作用途徑，將是下一步研究的重點(diǎn)。

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［2］楊惠鈴，李繼功，溫寧.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015，13（6）：352-354.DOI：10.3969/j.issn.1672-2973.2015.06.009.

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（編輯 陳姜）

Effect of Curcumin Combined with Cisplatin on Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Tca-8113 Cells

TONG Zhou，LIU Changfu，TAN Jingyu，WANG Zhiying

（Department of Oral&Maxillofacial Surgery，The Second Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

Objective To observe the effect of curcumin combined with cisplatin on the proliferation of human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells，and explore the possible mechanism of their anti-tumor effect in vitro.MethodsIn this study，the samples were divided into four groups:curcumin，cisplatin，curcumin combined with cisplatin，and control.Detection of rate of inhibition of Tca-8113 cell proliferation was carried out by MTT assay.This was followed by observation of the morphological changes of the nuclei by Hoechst 33258 fluorescence staining.Subsequently，cellular apoptosis was assayed by flow cytometry，and expression of Notch1 and epidermal growth factor receptor（EGFR）was examined by Western blotting.ResultsResults of MTT assay showed that curcumin combined with cisplatin inhibited the proliferation of tongue squamous cell carcinoma to a greater extent than either curcumin or cisplatin alone（P＜0.05）.Flow cytometry analysis indicated that，unlike curcumin or cisplatin alone，curcumin combined with cisplatin noticeably induced apoptosis（P＜0.05）.Results of Western blotting revealed that the expression of Notch1 was upregulated，whereas the expression of EGFR was downregulated to a greater extent in the control group than in cells treated with curcumin or cisplatin alone.Unlike curcumin and cisplatin groups，the combined group revealed statistically significant expressions of Notch1 and EGFR（P＜0.05）.ConclusionCurcumin and cisplatin have a combined effect on inhibition of proliferation of human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells.The mechanism may be related to upregulation of the Notch1 signaling pathway and downregulation of the EGFR signaling pathway.

curcumin；cisplatin；human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells；cell apoptosis；signal pathway

R782

A

0258-4646（2017）06-0552-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.017

佟周（1987-），女，碩士研究生.

王稚英，E-mail：bdwzy@126.com

2016-09-26

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