尹建國(guó)，張社兵，彭道泉

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東韶關(guān)512026；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科，長(zhǎng)沙410011）

載脂蛋白AI對(duì)單核細(xì)胞表型與MCP-1/CCR2的影響

尹建國(guó)1，2，張社兵1，彭道泉2

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東韶關(guān)512026；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科，長(zhǎng)沙410011）

目的探討載脂蛋白AI（apoAI）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血液、脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）濃度及CC類趨化因子受體2（CCR2）表達(dá)的影響。方法16只雄性apoE-/-小鼠高脂飼料飼養(yǎng)12周后隨機(jī)分為對(duì)照組和apoAI組，處死前第1、3天分別予以生理鹽水和apoAI（40 mg/kg）干預(yù)，處死12 h前予以腹腔注射脂多糖（LPS）25 μg/只，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血漿MCP-1濃度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液、脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞比例。THP-1細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和apoAI組，予以相應(yīng)干預(yù)后加入濃度為10 μg/L的LPS孵育，Western blotting檢測(cè)2組中CCR2的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，apoAI能顯著降低血液及脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞比例及血漿中MCP-1濃度（P＜0.01），體外研究顯示apoAI能下調(diào)單核細(xì)胞CCR2的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論apoAI能降低MCP-1濃度及血液、脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞比例，抑制CCR2的表達(dá)。

載脂蛋白AI；單核細(xì)胞表型；單核細(xì)胞趨化蛋白1；CC類趨化因子受體2

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的本質(zhì)是慢性炎癥性疾病，血脂代謝異常、單核細(xì)胞參與了AS發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。研究［1-3］表明，單核細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞，可分為促炎型和靜息型2種主要亞型，在小鼠體內(nèi)對(duì)應(yīng)CD11b+Ly6ChighCCR2+CX3CR1low（Ly6Chi）單核細(xì)胞和CD11b+Ly6ClowCCR2-CX3CR1high（Ly6Clow）單核細(xì)胞，2種亞型單核細(xì)胞在AS中起不同作用；Ly6Chi高表達(dá)CCR2，主要與其配體MCP-1結(jié)合，受單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的調(diào)控趨化，易遷移至內(nèi)皮下形成泡沫細(xì)胞，有促炎、促AS的作用。Ly6Clow能吞噬壞死組織、促進(jìn)組織修復(fù)，起到抗炎、抗AS的作用。載脂蛋白AI（apolipoprotein AI，apoAI）有抗炎作用，但是apoAI對(duì)于單核細(xì)胞表型及MCP-1/CC類趨化因子受體2（C-C chemokine repter-2，CCR2）的影響研究較少，本研究旨在探討apoAI對(duì)單核細(xì)胞表型及MCP-1/CCR2的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，高脂飼料購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?；CCR2、β-actin兔抗人一抗購(gòu)自Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；CD11b-PE單抗、Ly6c-FITC單抗及同型對(duì)照單抗購(gòu)自Biolgend公司；MCP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海信帆生物公司；apoAI用質(zhì)粒在體外表達(dá)純化取得，純度＞99%，由湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)公司協(xié)助完成。THP-1細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞生物所，為汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵化人民醫(yī)院心血管內(nèi)科傳代保留，其余試劑均為中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 apoE-/-小鼠的分組與干預(yù)

16只apoE-/-小鼠高脂飼料飼養(yǎng)12周后隨機(jī)分為2組，每組8只。對(duì)照組小鼠處死前第1、3天尾靜脈注射生理鹽水；apoAI組處死前第1、3天尾靜脈注射apoAI（40 mg/kg）；所有組小鼠處死12 h前予以腹腔注射LPS 25 μg。所有小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天處死，結(jié)束前12 h禁食禁飲。

1.3 分離血漿及脾臟中單個(gè)核細(xì)胞

小鼠摘除眼球取血，置入抗凝管中，離心分離血漿和血細(xì)胞，血漿置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；血?xì)胞中加入2 mL RPMI1640液混勻，離心管中預(yù)先加入淋巴細(xì)胞分離液約5 mL，再將稀釋混勻的血細(xì)胞液體緩慢加于分離液面上離心后收集第2層白色云霧層，單個(gè)核細(xì)胞都在此層，洗滌離心后得到單個(gè)核細(xì)胞，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。脾臟分離后將脾臟置于100目無(wú)菌篩網(wǎng)上輕柔研磨，用RPMI1640液沖洗，收集脾細(xì)胞分離液，離心后加紅細(xì)胞裂解液混懸裂解紅細(xì)胞，離心，洗滌離心后所得為單個(gè)核細(xì)胞，加入含有10%FBS的RPMI1640液重懸細(xì)胞備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)

THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清，100 kU/L青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基置于含5% CO2、37℃且濕度100%的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好后計(jì)數(shù)隨機(jī)分為對(duì)照組（予以無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h）和apoAI組（無(wú)血清培養(yǎng)基加入10 mg/L apoAI孵育3 h），每組1.5×106個(gè)細(xì)胞，2組均加入濃度為10 μg/L的LPS，孵育6 h。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

按流式細(xì)胞抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每管結(jié)合細(xì)胞數(shù)量加入適量抗體，然后上機(jī)檢測(cè)Ly6Chi單核細(xì)胞的比例。

1.6 Western blotting檢測(cè)CCR2表達(dá)

分組干預(yù)的細(xì)胞裂解高速離心后取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，取50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液浸泡封閉2 h，加入1∶1 000的CCR2一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日PBST液漂洗3次，相應(yīng)稀釋后二抗室溫孵育2 h，再PBST液漂洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，在柯達(dá)化學(xué)發(fā)光成像儀中自動(dòng)顯影。用圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，所測(cè)得的各目的蛋白的灰度值與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值即為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血漿中MCP-1濃度

血漿解凍后用ELISA試劑盒檢測(cè)MCP-1濃度，按照ELISA試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，根據(jù)各樣本在酶標(biāo)儀450 nm處的OD值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性分析，凡不符合正態(tài)分布的變量均先經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，再做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。2組均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用x±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 apoAI對(duì)LPS刺激血液中Ly6Chi單核細(xì)胞比例的影響

apoAI組與對(duì)照組比較，流式細(xì)胞儀檢測(cè)apoAI能明顯降低血液中Ly6Chi單核細(xì)胞的百分比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

2.2 apoAI對(duì)LPS刺激脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞比例的影響

apoAI組與對(duì)照組比較，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示apoAI能明顯降低脾臟中Ly6Chi單核細(xì)胞的百分比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 apoAI對(duì)LPS刺激THP-1細(xì)胞CCR2表達(dá)的影響

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)apoAI對(duì)LPS刺激血液中Ly6Chi細(xì)胞比例的影響Fig.1 Proportion of Ly6Chimonocytes stimulated by LPS in the blood as detected by flow cytometry

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)apoAI對(duì)LPS刺激脾臟中Ly6Chi細(xì)胞比例的影響Fig.2 Proportion of Ly6Chimonocytes stimulated by LPS in the spleen as detected by flow cytometry

圖3 Western blotting檢測(cè)CCR2蛋白表達(dá)Fig.3 CCR2 expression levels as measured by Western blotting

與對(duì)照組比較，apoAI能抑制LPS誘導(dǎo)的CCR2表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 apoAI對(duì)LPS刺激血漿中MCP-1濃度的影響

與對(duì)照組比較，apoAI能明顯抑制LPS刺激的血漿中MCP-1濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

3 討論

圖4 apoAI干預(yù)對(duì)LPS刺激apoE-/-小鼠血漿MCP-1濃度的影響Fig.4 apoAI treatment reduces MCP-1 plasma levels in apoE-/-mice induced by LPS

單核細(xì)胞在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，單核細(xì)胞可分為L(zhǎng)y6Chi和Ly6Clow2種主要亞型，Ly6Chi上有CCR2表達(dá)，可在MCP-1的刺激下向內(nèi)皮下趨化、遷移，較Ly6Clow更易浸潤(rùn)遷移至斑塊內(nèi)，轉(zhuǎn)化成M1型巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展［4-5］。MCP-1是趨化細(xì)胞因子家族中的一員，主要由單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在受到刺激時(shí)分泌，其受體是CCR2，MCP-1/CCR2結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮作用，能趨化更多的單核細(xì)胞向內(nèi)皮下浸潤(rùn)。有研究［6］證實(shí)CCR2-/-apoE-/-小鼠與apoE-/-小鼠比較，血液中促炎型單核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，減輕了AS的程度。MAJMUDAR等［7］的研究表明針對(duì)單核細(xì)胞CCR2的siRNA干預(yù)能減少血液中Ly6Chi單核細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)心肌梗死的愈合。

apoAI是HDL的主要蛋白成分，在體內(nèi)主要作為三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1的受體，介導(dǎo)泡沫細(xì)胞中游離膽固醇及磷脂的流出，apoAI除了通過(guò)促膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)起抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用外，apoAI還有抗炎作用，有研究［8］表明在慢性腎病患者，血液中apoAI濃度降低與促炎型單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈反比，能預(yù)測(cè)患者心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，apoAI在體外能抑制單核細(xì)胞CCR2表達(dá)，在體內(nèi)能降低MCP-1的血漿濃度。抑制骨髓中Ly6Chi單核細(xì)胞向血液中釋放及在脾臟中聚集。

已有研究［9］證實(shí)，脾臟不僅是免疫器官，還是髓外“單核細(xì)胞庫(kù)”，在高脂血癥及其他病理情況下，脾臟還能髓外造血，釋放Ly6Chi單核細(xì)胞入血浸潤(rùn)至斑塊中，促進(jìn)AS的發(fā)展。心肌梗塞后能激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，直接激活CCR2+祖細(xì)胞干細(xì)胞，同時(shí)使脾臟中大量Ly6Chi細(xì)胞源源不斷的釋放入血趨化于斑塊，激活放大炎癥，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈事件的反復(fù)發(fā)生，出現(xiàn)“心肌梗死加劇AS”現(xiàn)象［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，apoAI不但能降低血液中Ly6Chi細(xì)胞的比例，還能降低脾臟中Ly6Chi細(xì)胞的比例，起抗炎、抗AS的作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，apoAI在體內(nèi)能降低血漿中MCP-1濃度，降低血液及脾臟中Ly6Chi細(xì)胞比例的作用，在體外能抑制單核細(xì)胞CCR2的表達(dá)，說(shuō)明apoAI能調(diào)控CCR2的表達(dá)，從而調(diào)控單核細(xì)胞向Ly6Clow細(xì)胞分化，提示apoAI降低了血液及脾臟中Ly6Chi細(xì)胞比例是通過(guò)抑制CCR2、MCP-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，這為深入理解apoAI的抗炎機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯 于溪）

Effect of Apolipoprotein AI on MCP-1 Plasma Levels，Monocyte Subset Proportions，and in Vitro CCR2 Expression

YIN Jianguo1，2，ZHANG Shebing1，PENG Daoquan2

（1.Department of Cardiology，Yuebei People’s Hospital Affiliated to Shantou University Medical College，Shaoguan 512026，China；2.Department of Cardiology，The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011，China）

Objective To explore effects of apoAI on MCP-1 levels in the plasma and the Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen of atherosclerotic mice，as well as on CCR2 expression in vitro.MethodsSixteen male apoE-/-mice were fed with high cholesterol diet for 12 weeks. Mice were randomly divided into control and apoAI groups and were administered with PBS or apoAI（40 mg/kg），respectively，via tail vein on the 1st and 3rd day before sacrifice.Mice in both groups were administered LPS（25 μg/mouse）via intraperitoneal injection 12 h before sacrifice.Plasma levels of MCP-1 were determined using ELISA，and the Ly6Chimonocyte proportion was analyzed using flow cytometry.In addition，human monocytic THP-1 cells were randomly divided into control and apoAI（10 mg/L）-treated groups，pretreated with corresponding intervention，and incubated with LPS（10 μg/L）.CCR2 expression levels were measured by Western blotting.ResultsCompared with the control treatment，apoAI treatment remarkably reduced MCP-1 levels in plasma and Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen（P＜0.01）.Furthermore，apoAI treatment inhibited CCR2 expression in monocytes in vitro（P＜0.05）.ConclusionapoAI can reduce MCP-1 levels in plasma and the Ly6Chimonocyte proportion in the blood and spleen and can inhibit CCR2 expression in monocytes in vitro.

apolipoprotein AI；monocyte subset；monocyte chemotactic protein 1；CC-chemokine receptor 2

R543.3

A

0258-4646（2017）06-0501-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370393）

尹建國(guó)（1978-），男，副主任醫(yī)師，博士.

彭道泉，E-mail：pengdq@hotmail.com

2016-10-12

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：