曹自 孫保存③ 趙秀蘭③ 張艷輝 古強③ 梁曉輝③ 董學易③ 趙楠③

Runx2通過促進MMP9的表達增強肝細胞肝癌遷移侵襲能力*

曹自①孫保存①②③趙秀蘭①③張艷輝②古強①③梁曉輝①③董學易①③趙楠①③

目的：研究Runx2對肝癌細胞中MMP9的表達以及其對肝癌細胞侵襲遷移能力的影響。方法：通過免疫組織化學染色法對2005年12月至2015年12月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學總醫(yī)院189例肝細胞肝癌病例標本中Runx2和MMP9的表達進行分析；將Runx2過表達質粒和干擾質粒分別轉染至肝癌細胞系HepG2和SMMC7721細胞中。使用Western blot法檢測轉染后HepG2和SMMC7721細胞中Runx2和MMP9的表達情況；劃痕、侵襲實驗檢測Runx2對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。結果：免疫組織化學結果顯示Runx2的表達和MMP9的表達相關。在HepG2細胞中上調Runx2的表達，促進了MMP9的表達，增強了HepG2細胞遷移侵襲能力；在SMMC7721細胞中下調Runx2的表達，降低了MMP9的表達，抑制了SMMC7721細胞的遷移侵襲能力。結論：Runx2的表達可能參與促進肝細胞肝癌細胞MMP9的表達，進而促進肝細胞肝癌的遷移侵襲能力。

肝細胞肝癌 Runx2 MMP9 遷移 侵襲

在世界范圍內，原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在男性最常見腫瘤中位居第5位，女性最常見腫瘤中位居第7位，在癌癥導致的死亡病例中位居第3位。我國是HCC的高發(fā)地區(qū)，僅2012年我國的肝癌病例數(shù)就占全球范圍內肝癌病例數(shù)的一半以上。目前，HCC的治療主要以手術切除為主。雖然治療水平不斷提高，肝癌患者術后的5年生存率僅約30%，這與肝癌的高侵襲性和轉移密切相關［1-2］。HCC的轉移是一個較為復雜的多步驟過程：腫瘤細胞失去正常細胞間連接，穿過基膜進入細胞間質，穿過血管內皮進入血流，進而播散到遠處器官。

腫瘤細胞合成和分泌蛋白酶降解基膜和細胞外基質是轉移的前提。MMP9屬于基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族，是一類鋅依賴的肽鏈內切酶，參與細胞外基質的降解，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤細胞侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用。研究表明MMP9的表達促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［3-4］。

Runx2屬于RUNX家族，是一類轉錄因子。實驗證明Runx2在腫瘤的侵襲轉移過程中發(fā)揮重要的作用［5-10］。有研究證實Runx2可以通過結合MMP9的啟動子來促進MMP9的表達［9］。目前，關于Runx2在肝癌中調控MMP9及肝癌遷移侵襲關系的研究尚少。

本研究首先通過免疫組織化學染色方法檢測肝癌組織中Runx2和MMP9的表達情況，并分析了Runx2的表達與MMP9的表達相關性。之后分別轉染Runx2過表達質粒至HepG2細胞，轉染Runx2降表達質粒至SMMC7721細胞。使用Western blot法檢測轉染后HepG2細胞和SMMC7721細胞Runx2的表達水平和MMP9的表達水平，同時通過劃痕和Transwell實驗觀察細胞侵襲遷移能力的變化。研究在肝細胞肝癌細胞中，Runx2的表達能否通過促進MMP9的表達從而促進肝癌的遷移侵襲能力。本研究旨在為HCC的臨床治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 選取2005年12月至2015年12月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學總醫(yī)院行手術切除，病理診斷為原發(fā)性HCC并且隨訪資料完整的患者標本89例。全部病例均為手術標本且患者術前未接受放、化療，由兩位資深病理醫(yī)師診斷切片確診為肝癌，組織標本及病例資料的使用均經(jīng)天津醫(yī)科大學倫理委員會審查批準，并被患者及其家屬知情同意。

1.1.2 細胞株 人肝癌細胞株HepG2，SMMC7721細胞系（購自美國ATCC公司）。

1.1.3 實驗試劑 MEM、RPMI-1640培養(yǎng)基（購自美國Neuronbc公司）。Opti-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）（購自美國ThermoFisher公司）。Runx2過表達質粒（Catalog No.：EX-H5214-Lv201），Runx2過表達對照質粒（Catalog No.：EX-NEG-Lv201），Runx2降表達質粒（Catalog No.：HSH021333-LVRU6GP），Runx2降表達對照質粒（Catalog No.CSHCTR001-LVRU6GP）。Transwell小室（購自美國FALCON公司）。小鼠抗人Runx2抗體，兔抗人MMP9抗體，兔抗人β-actin抗體均（購自英國Abcam公司）。山羊抗兔IgG抗體，山羊抗鼠IgG抗體（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 肝癌組織石蠟標本連續(xù)切片脫蠟水化，使用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，微波修復；于室溫正常血清封閉，一抗置于4℃冰箱過夜，次日常溫下孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹脂封片。陰性對照用PBS代替一抗。染色結果判斷標準參考文獻［11］。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系HepG2，SMMC7721按照常規(guī)培養(yǎng)模式進行培養(yǎng)，HepG2培養(yǎng)基為MEM+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）；SMMC7721培養(yǎng)基為RPMI-1640+10%FBS+1%雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱。

1.2.3 細胞轉染 在6孔板中培養(yǎng)細胞至約70%時，更換不含血清和雙抗的培養(yǎng)基，以1:4比例混勻PEI轉染試劑盒質粒，室溫靜置20 min后加入培養(yǎng)基中，6 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后評價轉染效果。

1.2.4 Western blot法檢測 使用RIPA-SDS裂解細胞，提取總蛋白。先在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF膜轉膜90 min。用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，根據(jù)實驗需要分別加入Runx2（1:500），MMP9（1:500），β-actin（1:2 000），4℃孵育過夜，次日恢復室溫后TBST洗膜3次，再與相應山羊抗兔或抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h，用TBST漂洗PVDF膜3次，加入發(fā)光液，在發(fā)光儀上顯影，照相。蛋白條帶的灰度定量分析使用Image J軟件處理。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將細胞均勻接種于6孔板中，待細胞長到70%密度時，使用100 μL槍頭在細胞平面進行劃痕，洗掉離壁細胞，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。將此時記為劃痕0 h，分別在0、24、48 h倒置顯微鏡下拍攝同一位置視野，并測量和記錄劃痕距離，計算遷移率。

1.2.6 細胞侵襲實驗 前一天在Transwell小室中加入30 μL Matrigel，放置于24孔板中，于培養(yǎng)箱中過夜。待Matrigel凝固后，用無血清培養(yǎng)基制細胞懸液，于上室200 μL加入細胞懸液，24孔板小孔加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用冷甲醇固定，0.4%結晶紫染色，于倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料分析采用t檢驗。病例計數(shù)資料采用Chi-square test，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Runx2的表達和MMP9的表達關系

免疫組織化學染色后陽性表達呈棕黃色，Runx2陽性表達定位于肝細胞胞核（圖1），MMP9的陽性表達定位于肝細胞胞質中（圖2）。免疫組織化學染色結果顯示，在89例肝癌標本中Runx2陽性表達率為61.8%，MMP9的陽性表達率為51.7%；在Runx2的陽性組中MMP9陽性率為61.8%，在Runx2的陰性組中MMP9陽性率為35.2%。MMP9在Runx2的陽性組中陽性率高于在Runx2的陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義（表1）。

圖1 Runx2在人肝癌組織中定位于細胞核的陽性表達（H&E×200）Figure 1 Positive expression of Runx2 located in nucleus in hepatocellular carcinoma specimens(H&E×200)

圖2 MMP9在人肝癌組織中定位于細胞漿的陽性表達及陰性表達（H&E×200）Figure 2 Positive expression of MMP9 located in cytoplasm in hepatocellular carcinoma specimens(H&E×200)

表1 HCC標本中Runx2與MMP9的關系Table 1 Correlation between Runx2 and MMP9 in HCC samples

2.2 Runx2和MMP9的表達與HCC患者臨床病理資料的關系

分析Runx2和MMP9的表達與HCC患者臨床病理資料的關系顯示，Runx2和MMP9的表達在不同病理分級的患者中不同，Runx2和MMP9在低分化（Ⅲ/Ⅳ級）的患者中表達高于高分化（Ⅰ/Ⅱ級）的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.633，P=0.025）。Runx2和MMP9在肝癌轉移的患者中表達高于肝癌無轉移的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=4.492，P=0.049）。Runx2和MMP9在不同年齡、不同性別、是否有乙型肝炎、是否有肝硬化、腫瘤大小患者中的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表2）。生存分析，結果顯示，Runx2和MMP9的表達均為陽性的患者較Runx2和MMP9均陰性的患者生存時間相對較短（圖3）。

表2 HCC標本中Runx2和MMP9與肝癌臨床病理資料的關系Table 2 Correlation between Runx2 MMP9 and clinicopathological data of HCC patients

圖3 Runx2（+）MMP9（+）患者較Runx2（-）MMP9（-）患者生存時間相對較短Figure 3 Kaplan-Meier survival analysis showed that Runx2(+)MMP (+)patients had shorter survival period than Runx2(-)MMP(-)patients

2.3 轉染后細胞中Runx2，MMP9的表達變化

使用Western blot法來檢測轉染后HepG2，SMMC7721細胞中Runx2和MMP9的表達情況。結果顯示，轉染Runx2過表達質粒的HepG2細胞，與對照組比較，Runx2表達水平上升，MMP9的表達水平上升（圖4）。轉染Runx2降表達質粒的SMMC7721細胞與對照組相比較，Runx2表達水平下降，MMP9的表達水平也下降（圖4）。實驗結果說明Runx2可以促進MMP9的表達。

圖4 HepG2細胞轉染Runx2過表達質粒和SMMC7721轉染Runx2降表達質粒后Runx2和MMP9的表達情況Figure 4 Expression of Runx2 and MMP9 in HepG2 and SMMC7721 cells after transfection with overexpression or knockdown plasmid of Runx2

2.4 Runx2對HCC遷移運動能力的影響

劃痕實驗結果：HepG2細胞過表達Runx2后，與對照組相比，在24、48 h時間點，其細胞遷移能力增強，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖5）；SMMC7721細胞下調Runx2后，與對照組相比，在24、48 h時間點，其細胞遷移能力減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖5）。

圖5 過表達 Runx2對HepG2細胞遷移能力的影響Figure 5 Effects of Runx2 on the migration capacity of HepG2 cells

2.5 Runx2對HCC細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示：HepG2細胞上調Runx2后，與對照組相比，穿過小室的細胞數(shù)增多（圖6）；SMMC7721細胞下調Runx2表達后，與對照組相比，穿過小室的細胞數(shù)減少（圖7）。結果提示，Runx2可以增強HCC細胞的侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖6 下調Runx2表達對SMMC7721細胞遷移能力的影響Figure 6 Effects of Runx2-shRNA on the migration capacity of SMMC7721 cells

圖7 過表達Runx2對HepG2細胞侵襲能力的影響和降表達Runx2對SMMC7721細胞侵襲能力的影響Figure 7 Effects of Runx2 overexpression or knockdown on invasion capacity of HepG2 and SMMC7721 cells

3 討論

Runx2是RUNX（Runt相關的轉錄因子）轉錄因子家族的成員之一，通過核心結合子（core binding factor，CBF）結合DNA來調控基因的表達。RUNX家族是哺乳動物的發(fā)育過程中要素之一，尤其對成骨具有重要作用［12-13］。近年來，關于Runx2的研究表明其在腫瘤的侵襲遷移和轉移過程發(fā)揮重要作用［14］。

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，由于其侵襲性高、易轉移、肝癌患者的術后復發(fā)率高，預后較差，5年生存率低，死亡率高。近年來，肝癌的治療水平不斷提高，但治療效果不佳。腫瘤的轉移是一個復雜的多步驟過程，腫瘤細胞合成和分泌MMPs降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［15］。MMP9降解Ⅳ型膠原蛋白，為腫瘤細胞轉移開通通道，此外還促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移［3-4］。研究表明肝癌中MMP9的高表達與高侵襲能力相關［16］。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，Runx2與MMP9啟動子區(qū)域結合，激活MMP9內源性表達促進腫瘤細胞的侵襲轉移能力，突變的Runx2與MMP9啟動子區(qū)的結合導致MMP9轉錄水平的顯著下降［10］。本研究推測Runx2可能在肝癌中通過調控MMP9的表達來調控肝癌細胞的遷移侵襲能力。

人肝癌組織免疫組織化學結果顯示，Runx2的表達與MMP9的表達相關，生存分析結果顯示，Runx2和MMP9共表達的肝癌患者，較Runx2和MMP9均為陰性表達的患者，生存時間較短。細胞轉染后，上調Runx2的HepG2細胞與對照組相比，Runx2和MMP9的表達水平上升。而下調Runx2的SMMC7721細胞與對照組相比，Runx2和MMP9的表達水平下降。同時細胞功能學實驗也證實，上調Runx2后HepG2細胞的遷移侵襲能力較對照組增強，而降低SMMC7721細胞Runx2的表達后，細胞的遷移侵襲能力較對照組降低。

結合上述研究結果，本研究提示Runx2的表達可能參與促進肝細胞肝癌細胞MMP9的表達，進而促進HCC的遷移侵襲能力，為肝癌的臨床治療提供一個新靶點。關于Runx2在肝癌中如何調控MMP9的表達機制及相關通路的相互作用關系亟需進一步的研究。

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（2017-03-07收稿）

（2017-03-28修回）

（編輯：鄭莉 校對：孫喜佳）

Runx2 promotes migration and invasion abilities of hepatocellular carcinoma by inducing MMP9 expression

Zi CAO1,Baocun SUN1,2,3,Xiulan ZHAO1,3,Yanhui ZHANG2,Qiang GU1,3,Xiaohui LIANG1,3,Xueyi DONG1,3,Nan ZHAO1,3

Baocun SUN;E-mail:sunbaocun@aliyun.com
1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China;3Department of Pathology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81572872),and Key project of the National Natural Science Foundation of China(No.81230050)

Objective:To examine the expression of Runx2 in hepatocellular carcinoma(HCC)cells and its effect on the migration and invasion and to evaluate the expression of Runx2 in inducing MMP9 expression.Methods:Immunohistochemistry staining was performed to investigate the relation between the expression of Runx2 and MMP9.Transfection with Runx2 overexpression plasmid in HepG2 cells were conducted to induce exogenous expression of Runx2 and Runx2 knockdown plasmid in SMMC7721 cells and to interfere the quantity of Runx2 protein.The expression of Runx2 and MMP9 in HepG2 and SMMC7721 cells were analyzed by Western blotting and compared with the control.For wound healing assays,cell motility was assessed by measuring the movement of cells into a scarp,and the invasion assay was used to determine the function of invasive potential.Results:Immunohistochemistry staining results revealed the association of Runx2 expression with MMP9 expression in HCC specimen.After transfection,Runx2 expression in HepG2 cells increased with the expression of MMP9 and enhanced cell motility and invasion.In SMMC7721 cells,Runx2 and MMP9 expression decreased and cell motility and invasion were inhibited.Conclusion:Runx2 might promote hepatocellular carcinoma migration and invasion by promoting MMP9 expression.

hepatocellular carcinoma,Runx2,MMP9,migration,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.09.046

①天津醫(yī)科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科；③天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科

*本文課題受國家自然基金面上項目（編號：81572872）和國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）資助

孫保存 sunbaocun@aliyun.com

曹自 專業(yè)方向為肝癌血管生成分子病理方面的研究。

E-mail：imcaozi@163.com