鄧怡晨，張 晨，向志光，滕永康，劉云波*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物膜及膜生物工程國家重點實驗室，北京大學(xué)麥戈文腦研究所，北京 100871)

研究報告

狨猴B2m基因沉默位點在細胞水平的驗證

鄧怡晨1，張 晨2，向志光1，滕永康1，劉云波1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物膜及膜生物工程國家重點實驗室，北京大學(xué)麥戈文腦研究所，北京 100871)

目的 在細胞水平篩選狨猴B2m基因的有效沉默靶點，并進行驗證。方法 查詢?nèi)嗽碆2m驗證過的有效siRNA靶位點序列，與狨猴B2m基因序列進行同源性比較，選擇匹配靶點合成shRNA序列。將體外合成的2條干擾序列分別與慢病毒載體 FUGW-TDT連接，構(gòu)建FUGW-TDT-shb2m干擾表達質(zhì)粒，在聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后48h，用實時熒光定量法檢測轉(zhuǎn)染細胞中B2m基因mRNA的水平。結(jié)果 篩選出2個與狨猴完全同源的B2m沉默靶位點，分別位于B2mmRNA 的290～310 bp，665～685 bp；B2m兩個靶點在轉(zhuǎn)錄水平的沉默效率分別為(46.54±7.91)%(P< 0.05)和(83.22±4.37)%(P< 0.0001)，差異有顯著性。結(jié)論 成功構(gòu)建成FUGW-TDT-shb2m重組質(zhì)粒；在細胞水平篩選得到2個有效的B2m基因沉默靶點；為后續(xù)有關(guān)介導(dǎo)狨猴B2m基因沉默的研究奠定了基礎(chǔ)。

基因沉默；狨猴；β2-微球蛋白；短發(fā)夾RNA

β2-微球蛋白(beta2-microglobulin，B2M)是一種內(nèi)源性低分子量血清蛋白質(zhì)，廣泛存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液以及初乳中。它是人細胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(major histocompatibility complex class I molecule，MHCI)的β鏈，由99個氨基酸組成，無多態(tài)性且高度保守，是CD8分子的結(jié)合區(qū)域[1]。

已有研究表明B2m基因缺陷小鼠在胸腺和外周淋巴器官幾乎缺乏所有成熟的CD4-8+T細胞，導(dǎo)致免疫功能缺陷[2]。目前免疫缺陷疾病動物模型的研究主要是使用大鼠和小鼠作為動物平臺，而非人靈長類動物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用較少。與嚙齒類動物相比較，非人靈長類動物與人類親緣關(guān)系和生理生化指標更加接近，因此，研究建立非人靈長類動物模型對于相關(guān)疾病的研究有重要意義[3]。

狨猴作為一種較小的新大陸猴，與實驗室內(nèi)其他常用的靈長類實驗動物，如狒狒、獼猴相比較，由于其體型較小(成年體重300～500 g)、易在實驗室內(nèi)籠養(yǎng)、便于實驗操作、具有較高的繁殖率、對人類細胞因子或激素具有交叉反應(yīng)性、具有獨特的行為和認知特性，其在生物醫(yī)藥科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)方面引起廣泛關(guān)注[4, 5]。本文從細胞水平篩選及驗證狨猴B2m基因的沉默靶位點，為進一步探究B2m基因在狨猴體內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細胞來至ATCC細胞庫；E.coliDH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；細胞培養(yǎng)基 DMEM 購自Hyclone；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶為Invitrogen-Gibco公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自康為世紀公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購購自TaKaRa公司；PCR試劑盒購自TaKaRa公司；shRNA合成由 Invitrogen 公司提供；引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；Trizol試劑由 Invitrogen 公司提供；Xho I和Xba I 購自New England Biolabs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 shRNA序列設(shè)計

從broad institute 網(wǎng)站中(http://www.broadin stitute.org/rnai/public/)查詢?nèi)嗽碆2m基因有效siRNA靶位點序列，通過與狨猴B2m基因序列進行同源比對，選擇完全匹配的兩條siRNA序列，設(shè)計shRNA序列[6, 7]，由Invitrogen 公司合成。

1.2.2 B2m-RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定

慢病毒載體FUGW-TDT含有Ubi啟動子(Ubiquitin promoter)調(diào)控的紅色熒光蛋白(tandem dimer tomato，TDT)報告基因，可與U6啟動子調(diào)控的RNA干擾片段共表達[8]。FUGW-TDT 載體經(jīng)Xho I和Xba I雙酶切線性化后回收，將兩條shRNA分別連入載體FUGW-TDT的U6啟動子下游，即構(gòu)建重組質(zhì)粒[9]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞中，涂布于50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，接種至含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)不超過16 h，進行菌液鑒定(菌液PCR及測序引物均為F: 5’ -AGGAAGATGGCTGTGAGG- 3’；R: 5’-GCCTTGTATCGTATAAGC- 3’)。選擇陽性克隆菌液進行質(zhì)粒抽提，經(jīng)過質(zhì)粒測序(北大儀器中心)，將成功插入目的片段的質(zhì)粒命名為FUGW-TDT-shb2m。本實驗的陰性對照為未導(dǎo)入shRNA的FUGW-TDT空質(zhì)粒。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在6孔板中培養(yǎng)293T細胞，每孔加入5×105個細胞，置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。24 h內(nèi)細胞密度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)的介導(dǎo)下，按PEI∶質(zhì)粒=3∶1的比例配制轉(zhuǎn)染混合物，將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)進細胞[10]。實驗設(shè)為重組質(zhì)粒組和空載質(zhì)粒組，其中，重組質(zhì)粒組包括FUGW-TDT-shb2m-1和FUGW-TDT-shb2m-2兩個，空載質(zhì)粒組為陰性對照，每個質(zhì)粒做3個復(fù)孔。48 h后觀察熒光并進行流式分選，收集帶有紅色熒光的細胞。

1.2.4 RT-PCR法檢測B2m基因mRNA表達水平

采用實時熒光定量PCR法分析各組轉(zhuǎn)染細胞中B2m基因mRNA的表達情況[11]。按照 Invitrogen Trizol Reagent說明書分別提取每組細胞總RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄條件為: 37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到的cDNA用于進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。B2m基因引物為：上游5’-GGCTATCCAGC GTACTCCAAA-3’下游5’- CACGGCAGGCATACTC ATCTT -3’，擴增長度為248 bp。內(nèi)參GAPDH的引物為：上游5’- TGACTTCAACAGCGACACCCA -3’，下游5’- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA -3’，擴增長度為121 bp。兩條引物均由primer5軟件設(shè)計得來。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗分析。以P< 0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 狨猴B2m基因shDNA寡核苷酸序列

根據(jù)狨猴B2m基因序列，依照shRNA的設(shè)計原則和broad institute網(wǎng)站中人源B2m基因有效siRNA靶位點序列，與狨猴B2m基因序列進行同源性比較，選擇完全匹配的兩個靶點(圖1)合成shRNA序列，共兩條核苷酸序列見表1。

2.2 B2M慢病毒沉默載體構(gòu)建

在靶點序列的正反向組合中間添加一個loop環(huán)結(jié)構(gòu)(序列為CTCAAGAGA)以便形成shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。另外在正義鏈模板的 5’端添加tcga，可與XhoI酶切后的粘性末端互補，在反義鏈模板的 5’端添加ctag，可與XbaI酶切后的粘性末端互補，使其能與空的干擾質(zhì)粒連接，由此合成靶序列的oligoDNA(圖2A)。之后將oligoDNA連接在U6啟動子的下游，成功構(gòu)建FUGW-TDT-b2m的shRNA載體(圖2B)。

圖1 狨猴B2m基因序列同源性比對分析Fig.1 Homology analysis of marmoset B2m gene sequence

序列名稱Name序列(5’-3’)Sequence(5’-3’)FUGW-TDT-shb2m-1Sense:tcgaccCTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTCAAGAGATACAAGAGATAGAAAGACCAGTTTTTTg-gaaatAntisense:ctagatttccAAAAAACTGGTCTTTCTATCTCTTGTATCTCTTGAGTACAAGAGAT-AGAAAGACCAGggFUGW-TDT-shb2m-2Sense:tcgaccTTCAATCTCTTGCACTCAAAGCTCAAGAGACTTTGAGTGCAAGAGATTGAATTTTTTg-gaaatAntisense:ctagatttccAAAAAATTCAATCTCTTGCACTCAAAGTCTCTTGAGCTTTGAGTG-CAAGAGATTGAAgg

注:(A)shRNA-1的雙鏈寡核苷酸DNA序列結(jié)構(gòu)；(B)FUGW-TDT-shb2m慢病毒載體。圖2 結(jié)構(gòu)示意圖Note.(A)Double-stranded DNA oligonucleotide sequence structure of shRNA-1;(B)FUGW-TDT-shb2m lentiviral vector.Fig.2 The frame of FUGW-TDT-shRNA

2.3 293T細胞中B2M豐度的檢測

選取293T細胞提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)普通PCR，電泳檢測細胞中B2m基因的豐度(圖3)。結(jié)果顯示293T細胞中B2m基因的表達，說明能夠選用293T細胞于基因抑制效率檢測。

注：(M)Marker；(1)293T。圖3 B2m含量檢測Note.(M)Marker；(1)293T.Fig.3 Detection of B2m abundance

2.4 慢病毒表達載體FUGW-TDT的XhoI和XbaI雙酶切結(jié)果

將慢病毒表達載體FUGW-TDT經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切后，產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(如圖4)表明：酶切片段大小10600 bp左右，與預(yù)期相符合。然后將其酶切產(chǎn)物采用膠純化回收試劑盒回收目的片段，用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

注：(M)DNAMarker；(1)經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切線性化后的質(zhì)粒載體。圖4 FUGW-TDT載體的雙酶切電泳結(jié)果Note.(M)DNA Marker；(1)Linearized plasmid XhoI and XbaI double digestion.Fig.4 Electrophoresis for production of FUGW-TDT vector by double digestion

2.5 菌液PCR鑒定陽性克隆

B2m基因shRNA的寡核苷酸序列，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切后的FUGW-TDT載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，每個平板挑取3個重組陽性克隆，進行菌液PCR鑒定陽性克隆。重組細菌克隆的PCR產(chǎn)物351 bp(插入片段為61 bp)，而經(jīng)雙酶切后沒有插入片段的FUGW-TDT空載體PCR產(chǎn)物為290 bp。作為對照(圖5)，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。證明B2m基因的shRNA已經(jīng)定向連入慢病毒表達載體中。

注：(M)DNAMarker；(1～3)FUGW-TDT-shb2m-1；(4～6)FUGW-TDT-shb2m-2。圖5 FUGW-TDT-shb2m載體菌液PCR鑒定結(jié)果Note.(M)DNA Marker；(1～3)FUGW-TDT-shb2m-1；(4～6)FUGW-TDT-shb2m-2.Fig.5 Results of PCR FUGW-TDT-shb2m identification

2.6 RT-PCR檢測293T細胞B2m基因的表達

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，實驗組中2個插入shRNA序列的重組質(zhì)粒對應(yīng)的B2m基因mRNA表達量都明顯低于對照組，其中,FUGW-TDT-shb2m-1組與對照組相比，其沉默效率為(46.54±7.91)%(P< 0.05)，F(xiàn)UGW-TDT-shb2m-2組與對照組相比，其沉默效率為(83.22±4.37)%(P< 0.0001)，實驗批數(shù)n=3，差異有顯著性(圖6)。

注：(TDT)對照組FUGW-TDT；(1)FUGW-TDT-B2m-1；(2)FUGW-TDT-b2m-2；與對照組FUGW-TDT相比，*P<0.05，***P< 0.0001。圖6 SYBR-Green法 Real-time PCR檢測B2m基因mRNA的表達(n=3)Note.(TDT)Control group FUGW-TDT;(1)FUGW-TDT-b2m-1;(2)FUGW-TDT-B2m-2; Compared with control group FUGW-TDT，*P<0.05，***P< 0.0001.Fig.6 Detection of B2m mRNA by SYBR-Green Real-time PCR

3 討論

很多種類的免疫缺陷動物模型已經(jīng)建立起來，在免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、自身免疫性疾病、微生物學(xué)等諸多方面發(fā)揮重要作用[12]。實驗室常用的免疫缺陷動物包括裸小鼠、SCID小鼠等，但相對于嚙齒類動物，非人靈長類動物在遺傳、進化、生理等方面與人類高度相似，被認為是最理想的疾病治療和預(yù)防藥物研究的模型，并已廣泛應(yīng)用于評估抗病藥物和疫苗的安全及藥代工作[13, 14]。

狨猴現(xiàn)在已經(jīng)成為重要的研制人類疾病模型的動物，在基因修飾動物研究方面有很多優(yōu)勢條件，比如相對成熟的輔助生殖技術(shù)和與人類進化的親緣性。近年來，狨猴在神經(jīng)科學(xué)方面及帕金森、肝炎等疾病動物模型方面具有重要地位[15]。但是, 狨猴疾病模型無法替代舊大陸猴在構(gòu)建HIV、結(jié)核病等人類疾病模型的獨特優(yōu)勢, 所以應(yīng)根據(jù)課題的需求和具備的條件，采用相應(yīng)的動物品種[16]。

B2m是通過非共價鍵與MHCI類分子的α鏈胞外段相互作用,不參與MHCI類分子同抗原多肽的結(jié)合,但對維持MHCI類分子天然構(gòu)型的穩(wěn)定性及其表達起關(guān)鍵作用。有文獻報道B2m基因缺陷小鼠表現(xiàn)為免疫缺陷，且B2m基因缺陷小鼠在無病原體環(huán)境下培養(yǎng)，可正常發(fā)育及繁殖[17]，為探究狨猴B2m基因沉默后是否有免疫降低甚至缺陷的現(xiàn)象，首先從細胞水平上篩選沉默效率高的B2m基因靶點。本文中，將篩選的B2m基因沉默靶點插入帶紅色熒光的慢病毒質(zhì)粒(FUGW-TDT)后轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，通過real-timePCR方法分析，結(jié)果表明在RNA干擾作用下，轉(zhuǎn)染的細胞中B2m基因在轉(zhuǎn)錄水平比對照組顯著降低，說明RNA干擾靶點有效，可以經(jīng)過病毒包裝后進行狨猴胚胎和個體水平上驗證實驗，為構(gòu)建狨猴免疫缺陷模型奠定基礎(chǔ)。

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Validation of the silencing site of marmosetB2mgene at the cellular level

DENG Yi-chen1，ZHANG Chen2,XIANG Zhi-guang1,TENG Yong-kang1,LIU Yun-bo1*

(1．Institude of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021，China;2．State Key Laboratory of Membrane Biology, School of Life Sciences; PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, Peking University,Beijing 100871)

Objective To screen and determine the effective silencing targets of β2- microglobulin(B2m)gene at the cellular level in marmoset．Methods By homology comparison of the b2m gene in human and theB2mgene in marmoset, choose homology small hairpin RNA(shRNA)sequences targeting marmosetB2mgene were designed, We choose homology small hairpin RNA(shRNA)sequences targeting designedB2mgene to make homology analysis, and insert into lentivirus-based gene silencing constructs FUGW-TDT. The vectors were transfected into HEK293T cells induced by polyethylenimine(PEI). The suppression ofB2mmRNA was detected by real-time PCR. Results Two gene-silencing sequences were screened that lied in 290～310 bp and 665～685 bp of the marmosetB2mmRNA, and have statistical significance in the silencing rate：(46.54±7.91)% (P< 0.05) and(83.22±4.37)%(P< 0.0001). Conclusions Two effective silencing target sequences are screened at cellular level, which can be further used in studies on gene silencing in marmoset．

Gene silence; Marmoset;B2m; shRNA

國家科技支撐計劃(2014BAI03B01)。

鄧怡晨(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：實驗動物學(xué)。E-mail： yichendeng007@126.com

劉云波，教授，研究方向：實驗動物質(zhì)量控制。E-mail： yunboliu@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0037-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.010

2016-12-30