張亞雯 時 紅 張宇明 王 玲 劉 玲

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腦血流圖室，河北 石家莊 050051)

氯吡格雷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

張亞雯 時 紅 張宇明 王 玲 劉 玲

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腦血流圖室，河北 石家莊 050051)

目的 探討氯吡格雷干預(yù)大鼠局灶性腦缺血再灌注(I/R)損傷模型的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法 選取Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組，I/R組及治療組(給予氯吡格雷干預(yù))，觀察各組大鼠行為障礙、腦梗死面積、含水量，組織病理學(xué)改變及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、程序化細(xì)胞死亡分子(PDCD)-5表達(dá)情況。結(jié)果 在神經(jīng)功能評分方面，與Sham組相比，I/R組及治療組評分顯著升高(P<0.05)；與I/R組相比，治療組顯著降低(P<0.05)。在腦梗死面積及含水量方面，與Sham組相比，I/R組及治療組均顯著升高(P<0.05)；與I/R組相比，治療組均顯著降低(P<0.05)。在組織病理學(xué)方面，Sham組海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)完整；I/R組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，核膜界線不清晰，血管充血嚴(yán)重；相比于I/R組，治療組間質(zhì)水腫緩解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整。在Caspase-3及PDCD-5表達(dá)方面，Sham組基本未見Caspase-3及PDCD-5陽性細(xì)胞；I/R組隨處可見大量Caspase-3及PDCD-5陽性細(xì)胞；相比于Sham組，治療組Caspase-3及PDCD-5陽性細(xì)胞含量明顯增加，但相對于I/R組含量明顯降低。結(jié)論 氯吡格雷可通過縮小梗死面積、減輕水腫情況抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子的生成而保護(hù)神經(jīng)功能，改善缺血性腦卒中疾病的進(jìn)展。

氯吡格雷；缺血再灌注損傷；半胱氨酸蛋白酶；程序化細(xì)胞死亡分子(PDCD)-5；細(xì)胞凋亡

目前，缺血性腦卒中沒有明確的致病機(jī)制，但盡早地恢復(fù)腦血流是治療疾病的根本〔1〕。針對缺血性腦卒中的動物模型——腦缺血再灌注(I/R)損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，最大程度地抑制凋亡保護(hù)神經(jīng)是治療的關(guān)鍵。研究證實(shí)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是與凋亡關(guān)系最為密切的因子之一，可水解底物蛋白，降解細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，導(dǎo)致染色體斷裂，最終使細(xì)胞走向死亡，其中Caspase-3是該家族中最為關(guān)鍵的因子〔2〕。程序化細(xì)胞死亡分子(PDCD)-5是近來研究與凋亡相關(guān)的因子，在多種疾病中起著重要作用〔3〕。氯吡格雷作為血小板聚集抑制劑，廣泛地應(yīng)用于腦梗死的臨床治療中，然而有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍然不清楚。本研究建立大鼠I/R模型，體外給予氯吡格雷干預(yù)，觀察其對模型的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 Wistar大鼠120只購于北京華阜康生物公司，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、I/R組、治療組(I/R后給予氯吡格雷治療)，每組40只。其中治療組在大鼠造模完成后次日給予7.71 mg·kg-1·d-1的氯吡格雷(賽諾菲制藥有限公司)灌胃治療。

1.2 動物模型構(gòu)建 參考相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕，建立I/R模型。7.2%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪開鼠頭部皮膚，頸正中切口，分離頸外動脈(ECA)、右側(cè)頸總動脈(CCA)及頸內(nèi)動脈(ICA)。在遠(yuǎn)處結(jié)扎ECA，并在主干上剪一小口，將線栓插入，使其經(jīng)ECA至CCA，插入長度為17～18 mm，直至感覺有阻力時停止，從而形成腦缺血模型，縫皮將大鼠安置于溫暖之處。2 h后打開傷口拔出線栓，使血流恢復(fù)，從而造成再灌注模型。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠出現(xiàn)以右前肢為重的偏癱及右側(cè)Horner征。Sham組操作同上，僅暴露各組血管，而不進(jìn)行線栓插入。

1.3 行為障礙評分 給藥3 d后，對大鼠進(jìn)行行為障礙評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕，為4分制。0分：未見相關(guān)行為障礙；1分：左側(cè)前爪無力；2分：推手術(shù)側(cè)肩部，可發(fā)覺對側(cè)的移動阻力降低；3分：大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)圈及行動歪倒；4分：無肢體活動；分值越高說明行為障礙越重。

1.4 腦梗死面積檢測 斷頭取大鼠腦組織，并做腦冠狀切片，應(yīng)用噻唑藍(lán)(TTC)染色測定，按照腦梗死區(qū)占整個腦切片的百分比測定腦梗死面積。

1.5 腦含水量測定 斷頭取大鼠腦組織，稱量濕質(zhì)量，置于110℃烤箱中烘烤48 h后稱量干質(zhì)量，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.6 腦組織病理形態(tài)檢測 斷頭取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腦組織形態(tài)。

1.7 免疫組化檢測Caspase-3及PDCD-5的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，抗原修復(fù)，添加Caspase-3及PDCD-5一抗(購于CST公司)過夜孵育，第2天二抗孵育，室溫靜置2 h，PBS清洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)及蘇木精染色，清洗后封片顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 行為障礙評分 與Sham組〔(0.19±0.26)分〕相比，I/R組及治療組神經(jīng)功能評分〔(3.11±0.87)分、(2.09±0.71)分〕顯著升高(P<0.05)；與I/R組相比，治療組顯著降低(P<0.05)。

2.2 腦梗死面積及含水量比較 與Sham組相比，I/R組及治療組腦梗死面積及含水量顯著升高(P<0.05)；與I/R組相比，治療組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 組織病理學(xué)改變 Sham組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)完整；I/R組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，核膜界線不清晰，血管充血嚴(yán)重；相比于I/R組，治療組間質(zhì)水腫較前緩解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整。見圖1。

2.4 Caspase-3及PDCD-5表達(dá)變化 光鏡下，Caspase-3、PDCD-5陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色。Sham組基本未見Caspase-3、PDCD-5陽性細(xì)胞；I/R組隨處可見大量Caspase-3、PDCD-5陽性細(xì)胞；相比于Sham組，治療組含量明顯增加，但相對于I/R組，治療組含量明顯降低。見圖2，圖3。

表1 各組腦梗死面積及含水量比較

與Sham組比較：1)P<0.05;與I/R組比較：2)P<0.05

圖1 各組大鼠HE染色

圖2 各組腦組織Caspase-3表達(dá)(×400)

圖3 各組腦組織PDCD-5表達(dá)(×400)

3 討 論

盡管I/R大鼠體內(nèi)存在多種發(fā)病機(jī)制，如炎癥、水腫、鈣超載等，然而最快及最早地恢復(fù)血流量仍是各種疾病治療的關(guān)鍵。若不及時給予相應(yīng)治療，缺血缺氧加重，就會造成缺血組織及細(xì)胞的凋亡和壞死，從而導(dǎo)致功能的不可逆性損傷。細(xì)胞凋亡是一種有序性的細(xì)胞死亡，是受多種基因調(diào)控的細(xì)胞正常死亡〔5〕。已有研究表明，主要有3條信號通路可以干預(yù)凋亡：(1)線粒體凋亡通路；線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要產(chǎn)能細(xì)胞器，為細(xì)胞的各種功能和穩(wěn)態(tài)的維持提供能量。該凋亡通路中重要的因子為細(xì)胞色素C及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路相關(guān)蛋白，接收到凋亡信號刺激后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)凋亡蛋白釋放，激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，從而誘發(fā)了細(xì)胞的程序性死亡〔6〕。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑：病理因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Caspase-12的高表達(dá)，從而誘發(fā)Caspase-3、PDCD-5等凋亡分子的激活〔7〕。(3)死亡受體通路：多種體外刺激物激活死亡受體，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3等效應(yīng)酶，從而引起細(xì)胞凋亡〔8〕。在多種凋亡通道中，Caspase-3處于凋亡系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，多種因子及通道均可激活Caspase-3分子，從而啟動細(xì)胞凋亡。Caspase-3降解底物的活性最強(qiáng)，活化的分子盡在凋亡細(xì)胞中表達(dá)，是反映細(xì)胞凋亡的重要因子〔9〕。PDCD-5是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡因子，其在凋亡過程中起著早期及始動性的功能，PDCD-5可誘發(fā)線粒體凋亡通路〔10〕。氯吡格雷作為一種血小板受體阻斷劑，因?yàn)檩^小的副作用廣泛應(yīng)用臨床，然而有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)說明氯吡格雷在I/R大鼠模型中可改善腦部水腫及梗死情況，可較大程度減緩I/R的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示氯吡格雷可通過降低Caspase-3及PDCD-5凋亡因子來干預(yù)疾病進(jìn)程，較大程度減低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況，與國內(nèi)報道〔11〕相符。

1 賈愛明,譚 婧,胡文梅,等.缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的體質(zhì)因素及中醫(yī)誘因〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(9):2435-7.

2 梁曉飛,王 銘,肖永紅,等.粉防己堿對小鼠肺成纖維細(xì)胞的凋亡及 Caspase-3蛋白的影響〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志,2016;32(6):531-3.

3 鮑曉蕾,潘留蘭,楊 麗,等.凋亡相關(guān)基因PDCD5在胃癌組織的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)藥,2016;11(9):63-4.

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6 姜福瓊,王劍松,鄧丹琪,等.植物藥提取物影響腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路的研究進(jìn)展〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志,2015;36(3):87-91.

7 潘圓未,平 鍵,徐列明,等.誘導(dǎo)活化肝星狀細(xì)胞凋亡主要信號通路的研究進(jìn)展〔J〕.臨床肝膽病雜志,2014;30(2):182-5.

8 邱志凌,張軍平,郭曉辰,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2014;36(1):102-7.

9 李 莉,古正濤,劉志鋒,等.Caspase-3在熱打擊誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014;30(6):871-4.

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11 鐘文娟.腦心通聯(lián)合雙聯(lián)抗栓防治冠脈內(nèi)微栓塞的動物實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.福州：福建醫(yī)科大學(xué),2010.

〔2017-01-10修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

張亞雯(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科疾病研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)10-2390-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.018