胡 青, 孫 健, 馮 睿, 張 甦, 于 泓, 張靜嫻, 毛秀紅, 季 申

(上海市食品藥品檢驗所, 上海 201203)

研究論文

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定食品中34種非法添加減肥類化合物

胡 青, 孫 健, 馮 睿, 張 甦, 于 泓, 張靜嫻, 毛秀紅, 季 申*

(上海市食品藥品檢驗所, 上海 201203)

建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定食品(含保健食品)中34種減肥類非法添加化合物的方法。采用Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),以0.1%(v/v)甲酸水溶液-含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液為流動相,梯度洗脫,在電噴霧離子源、正離子或負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測。西布曲明等29種化合物在0.5～10 μg/L范圍內(nèi)、氯噻嗪等5種化合物在2.5～50 μg/L范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99;西布曲明等29種化合物在5、10和20 μg/kg添加水平下的平均加標(biāo)回收率為49.2%～136.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～15.0%(n=6),氯噻嗪等5種化合物在25、50和100 μg/kg添加水平下的平均加標(biāo)回收率為51.5%～130.9%, RSD為0.8%～14.0%(n=6);西布曲明等29種化合物的檢出限為5 μg/kg,定量限為10 μg/kg,氯噻嗪等5種化合物的檢出限為25 μg/kg,定量限為50 μg/kg。本方法已應(yīng)用于實際樣品的測定,共檢出了12種化合物,有效打擊了非法添加行為。

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜;非法添加;減肥類化合物;食品

近年來,具有減肥降脂功效的食品和保健食品層出不窮,為了達(dá)到快速起效的目的,市場上存在部分食品和保健食品中非法添加具有相關(guān)功效化學(xué)藥品的情況[1,2]。過多地服用化學(xué)藥品易對人們的健康和生命造成威脅,因此減肥食品中化學(xué)藥品的非法添加問題已受到人們的廣泛關(guān)注。

與減肥功效相關(guān)的化合物主要包括抑制食欲類(如西布曲明及其衍生物等)、中樞興奮類(安非他明和麻黃堿等)、瀉下類和降脂類等。目前,國內(nèi)外關(guān)于非法添加化合物的檢測方法主要有顯色法[3]、薄層色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法[6,7]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[12]、液相色譜-核磁共振法[13]、酶聯(lián)免疫吸附法[14]等。顯色法和薄層色譜法一般作為快速檢測的方法;高效液相色譜法在定性方面有所欠缺;液相色譜-核磁共振法操作難度較大,儀器普及率低;酶聯(lián)免疫吸附法無法對不同類型的化合物同時檢測。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可實現(xiàn)多種化合物同時定性、定量分析,檢測靈敏度高,方法適用性強,易于推廣。

我國與減肥類保健食品非法添加相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)有3個:國家藥品檢驗補充檢驗方法檢驗項目批準(zhǔn)件2006004、2012005和食藥監(jiān)辦許[2010]114號文附件2。檢測標(biāo)準(zhǔn)中涉及的化合物只有8個:西布曲明、N-雙去甲基西布曲明、N-單去甲基西布曲明、麻黃堿、芬氟拉明、呋塞米、酚酞和咖啡因。因此建立簡便易行，靈敏度高，專屬性強，涵蓋范圍廣的檢測方法以支撐目前市場監(jiān)管需求已迫在眉睫。

本研究基于國內(nèi)外文獻(xiàn)[15-17]和十多年市場監(jiān)管檢測出的陽性化合物,確定了34種非法添加的減肥類相關(guān)的化合物。本研究綜合考慮提取效率和成本等因素,采用甲醇超聲提取,建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜同時檢測食品中34種非法添加減肥類化合物的方法,實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中多組分的同時定性、定量分析,滿足復(fù)雜基質(zhì)的高靈敏度檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀;Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜;B3500S-MT超聲波發(fā)生器(上海必能信超聲有限公司); Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)。

34種對照品的來源及相關(guān)信息見表1;乙腈、甲酸(色譜純,德國Merck公司);甲醇(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

表 1 34種化合物對照品的信息

表 1 (續(xù))

NIFDC: National Institutes for Food and Drug Control; TRC: Toronto Research Chemicals Inc.; USP: the United States Pharmacopeial Convention; EDQM: European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare; TLC: TLC Pharmaceutical Standards Ltd.

1.2 分析條件

色譜柱:Waters CORTECS T3 (100 mm×2.1 mm, 2.7 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液;梯度洗脫:0～5.0 min,95%A;5.0～22.0 min,95%A～2%A;22.0～27.0 min,2%A;27.0～27.5 min,2%A～95%A;27.5～32.0 min,95%A;流速:300 μL/min;進(jìn)樣量:1 μL。

離子源:電噴霧離子(ESI)源,正離子或負(fù)離子模式;離子源溫度:200 ℃;毛細(xì)管電壓:正離子模式4 000 V,負(fù)離子模式3 500 V;干燥氣流量:12 L/min;霧化氣壓力:172 kPa;鞘氣溫度:250 ℃;鞘氣(N2)流量:10 L/min;噴嘴電壓:正離子模式500 V,負(fù)離子模式2 000 V;采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測。34種化合物的母離子、子離子和碰撞能量(CE)見表2。

表 2 34種化合物的母離子、子離子和碰撞能量

表 2 (續(xù))

* Quantitative ion.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取氯噻嗪、氫氯噻嗪、普伐他汀鈉、呋塞米、吉非羅齊對照品(A組)適量,精密稱定,用甲醇溶解并配制質(zhì)量濃度為2.5、5、10、25、50 μg/L的系列混合對照品溶液A,在負(fù)離子模式下檢測;分別取其他29種對照品(B組)適量,精密稱定,用甲醇溶解并配制質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10 μg/L的系列混合對照品溶液B,在正離子模式下檢測。

1.4 樣品前處理

取適量固體樣品混勻,研細(xì),準(zhǔn)確稱取1.000 g粉末,置于具塞試管中,加入10 mL甲醇,密塞,稱重,超聲提取10 min,放冷至室溫后,再次稱重,用甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜(有機相型)過濾,收集續(xù)濾液,作為供試品溶液備用。

取適量液體樣品搖勻,吸取1.0 mL,置于具塞試管中,加入9 mL甲醇,密塞,稱重,超聲提取10 min,放冷至室溫后,再次稱重,用甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜(有機相型)過濾,收集續(xù)濾液作為供試品溶液,備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

由于甲醇對待測化合物的溶解性均較好,故以甲醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取。本實驗比較了不同超聲時間(5、10、15 min)對待測化合物提取效率的影響,結(jié)果表明，超聲10 min時，待測化合物的提取效率較高,且可以避免基質(zhì)中干擾成分的共流出。在實際樣品測定中,宜根據(jù)樣品添加量的實際濃度,進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?避免進(jìn)樣濃度過高,對儀器造成污染。2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究曾比較了分析時間為25、28和32 min時目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明,隨著分析時間的延長,目標(biāo)化合物與干擾基質(zhì)共流出的情況有所減少，綜合考慮檢測效率、分離效果等情況,采用梯度洗脫,將分析時間設(shè)定為32 min。

本研究比較了0.1%(v/v)甲酸水溶液-含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液、10 mmol/L甲酸銨溶液-乙腈和0.1% (v/v)甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸銨)-乙腈作為流動相時目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明,以0.1%(v/v)甲酸水溶液-含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液為流動相時,各待測化合物響應(yīng)好,靈敏度高,離子化效率最佳。 目標(biāo)化合物中苯丙醇胺等化合物的極性較大,保留時間較短,因此，0～5.0 min時，流動相采用高比例的水相，以延緩其出峰時間,并且能將兩組出峰較快的同分異構(gòu)體(苯丙醇胺和去甲偽麻黃堿、麻黃堿和偽麻黃堿)較好的分離；非諾貝特、奧利司他等化合物的非極性較強,15 min后采用較高比例的有機相洗脫,為盡可能減少在較高有機相比例洗脫時待測化合物與復(fù)雜基質(zhì)中干擾化合物共流出的情況,將有機相的比例設(shè)定為逐漸升高；最終以98%(v/v)的有機相沖洗色譜柱，再恢復(fù)到初始流動相比例。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別用甲醇溶解34種化合物，并配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用單針自動進(jìn)樣的方式分析目標(biāo)化合物。分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描,采用Agilent MassHunter Optimizer軟件自動篩選定量及定性離子對，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。將分子離子作為母離子,并給予一定的碰撞能量,對二級離子進(jìn)行全掃描,選取相對豐度較高的2個子離子分別作為定量和定性離子,并在MRM模式下進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、碎裂電壓等質(zhì)譜參數(shù)。氯噻嗪、氫氯噻嗪、普伐他汀、呋塞米、吉非羅齊5種化合物在負(fù)離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于正離子模式下的響應(yīng),因此上述5種化合物在ESI-模式下檢測；其余29種化合物在ESI+模式下檢測。34種化合物的總離子流色譜圖分別見圖1a和圖1b。

研究中發(fā)現(xiàn)，氟西汀的碎片離子中m/z大于50的只有m/z為148.0的碎片離子,通過擴大相對分子質(zhì)量的掃描范圍和參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]，發(fā)現(xiàn)了另一個響應(yīng)較好而且穩(wěn)定的碎片離子(m/z44.2),并且比m/z為148.0的碎片離子響應(yīng)強度更強。綜合考慮，采用m/z為44.2的碎片離子作為氟西汀的定量離子。

圖 1 不同模式下34種化合物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 34 compounds 1. phenylpropanolamine; 2. norpseudoephedrine; 3. ephedrine; 4. pseudoephedrine; 5. methylephedrine; 6. amphetamine; 7. methamphetamine; 8. caffeine; 9. phentermine; 10. lorcaserin; 11. bupropion; 12. fenfluramine; 13. indapamide; 14. phenolphthalein; 15. N-didesmethylsibutramine; 16. fluoxetine; 17. N-monodesmethyl sibutramine; 18. bisacodyl; 19. sibutramine; 20. benzyl sibutramine; 21. homosibutramine; 22. chlorosibutramine; 23. bezafibrate; 24. bumetanide; 25. lovastatin; 26. simvastatin; 27. rimonabant; 28. fenofibrate; 29. orlistat; 30. chlorothiazide; 31. hydrochlorothiazide; 32. pravastatin; 33. furosemide; 34. gemfibrozil.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

根據(jù)市場上常見的減肥產(chǎn)品,選擇了酵素梅、左旋肉堿泡騰片、減肥膠囊、酵素飲品、代餐餅干、減肥奶茶、減肥茶、左旋肉堿咖啡粉8種基質(zhì)作為代表性基質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，因咖啡粉和減肥茶中存在大量固有成分咖啡因,導(dǎo)致多種化合物的回收率偏差較大。以減肥茶為例,配制基質(zhì)對照后對化合物進(jìn)行回收率考察,結(jié)果表明,多種化合物的回收率均得到了明顯的改善,說明采用空白基質(zhì)提取液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液可以減小基質(zhì)效應(yīng),從而得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。因此在實際檢測中遇到如咖啡粉或減肥茶等復(fù)雜基質(zhì),在可以獲得類似空白基質(zhì)的前提下,使用基質(zhì)對照,可以更加準(zhǔn)確地對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 儀器精密度

取各對照品溶液(29種化合物為1 μg/L, 5種化合物為5 μg/L),連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果表明,各化合物峰面積的RSD均低于8%，說明儀器的穩(wěn)定性良好。

2.5.2 線性關(guān)系

對系列混合對照品溶液A和B進(jìn)行分析,以化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。結(jié)果表明,34種化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.5.3 加標(biāo)回收率

分別取上述8種基質(zhì)進(jìn)行分析,除在酵素飲品、減肥奶茶、減肥茶、左旋肉堿咖啡粉基質(zhì)中檢測到咖啡因外,其余基質(zhì)中均不含本方法所檢測的34種化合物。西布曲明等29種化合物在5、10、20 μg/kg的加標(biāo)水平下，氯噻嗪等5種化合物在25、50、100 μg/kg的加標(biāo)水平下進(jìn)行回收率和精密度試驗，每個水平做6個平行樣品。西布曲明等29種化合物的平均加標(biāo)回收率為49.2%～136.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～15.0%；氯噻嗪等5種化合物的平均加標(biāo)回收率為51.5%～130.9%, RSD為0.8%～14.0%(見表S1,詳見http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1703007-SI.pdf)。

表 3 34種化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

由于酵素飲品、減肥奶茶、減肥茶、左旋肉堿咖啡粉中均含有咖啡因,故未計算咖啡因的回收率。奧利司他在減肥茶制品中易受到干擾,故針對減肥茶、減肥奶茶、咖啡粉基質(zhì)僅定性,未計算回收率結(jié)果。按照GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn),低、中、高3個水平的加標(biāo)回收率一般要求為60%～120%,總體來看,回收率結(jié)果中有92%的數(shù)據(jù)位于60%～120%之間，說明所建立的方法定量準(zhǔn)確。

2.5.4 穩(wěn)定性

取供試品溶液,分別于放置0、24、48 h時進(jìn)樣測定,比較各化合物的峰面積。結(jié)果表明,34種化合物的RSD為2.1%～15.8%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 檢出限和定量限

向8種基質(zhì)樣品中添加低含量的34種化合物，以本方法可以檢出的含量作為檢出限,結(jié)果表明,正離子模式下，29種化合物的檢出限為5 μg/kg(固體)或5 μg/L(液體);負(fù)離子模式下,5種化合物的檢出限為25 μg/kg(固體)或25 μg/L(液體)；以可以準(zhǔn)確定量的含量作為定量限,結(jié)果表明,正離子模式下,29種化合物的定量限為10 μg/kg(固體)或10 μg/L(液體);在負(fù)離子模式下,5種化合物的定量限為50 μg/kg(固體)或50 μg/L(液體)。在減肥奶茶、減肥茶、咖啡粉等基質(zhì)中,奧利司他受基質(zhì)干擾較嚴(yán)重,回收率普遍偏低,且RSD值較大,故在固體沖飲品基質(zhì)中,奧利司他僅作定性檢測,檢出限為100 μg/kg。

為進(jìn)一步研究檢出限能否達(dá)到非法添加含量的測定要求,對34種化合物的臨床用量進(jìn)行調(diào)研,其中布美他尼的臨床用量最少，為0.5 mg/次。如果暫以1次1 g計,則最低起效的藥物含量為0.5 mg/g,即上述化合物至少添加0.5 mg/g才能起效。本方法的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.5 mg/g,符合實際非法添加含量測定的要求。

表 4 80批實際樣品的測定結(jié)果

2.6 實際樣品分析

本研究對市售樣品及某涉案專項樣品(共80批)進(jìn)行檢測,共檢出12種化合物,檢出頻次達(dá)40次(見表4)。并有多種化合物同時添加的情況,如同時添加西布曲明與酚酞,且添加含量差異較大,甚至添加含量是臨床用量的數(shù)倍,表明了非法添加的隨意性及不可預(yù)料性,對消費者健康具有較大危害。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定食品(含保健食品)中34種減肥類非法添加化合物的分析方法。方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確,現(xiàn)已轉(zhuǎn)化為國家食品補充檢驗方法,大幅增加了檢測非法添加化合物的種類,對打擊非法添加保障食藥安全提供了有力的技術(shù)支持。

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Platform Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 14DZ2294000); 2016 Food Detection Supplementary Method Development Project of the State Food and Drug Administration.

Determination of 34 illegally adulterated weight loss compounds in foods by ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

HU Qing, SUN Jian, FENG Rui, ZHANG Su, YU Hong,ZHANG Jingxian, MAO Xiuhong, JI Shen*

(ShanghaiInstituteforFoodandDrugControl,Shanghai201203,China)

An analytical method was developed for the determination of 34 illegally adulterated weight loss compounds in foods and dietary supplements by ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). A Waters CORTECS T3 column (100 mm×2.1 mm, 2.7 μm) was used with 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution-acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid as mobile phases by gradient elution. The compounds were detected by electrospray ion source in positive or negative mode with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The calibration curves showed good linearity in the range of 0.5-10 μg/L for 29 compounds such as sibutramine, and in the range of 2.5-50 μg/L for five compounds such as chlorothiazide. The correlation coefficients (r) of the standard calibration curves for the 34 analytes were all greater than 0.99. The recoveries of the 29 compounds at spiked levels of 5, 10 and 20 μg/kg were in the range of 49.2%-136.2%, and the RSDs were 0.7%-15.0% (n=6). The recoveries of the five compounds at spiked levels of 25, 50 and 100 μg/kg were in the range of 51.5%-130.9%, and the RSDs were 0.8%-14.0% (n=6). The limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) were 5 μg/kg and 10 μg/kg for the 29 compounds, 25 μg/kg and 50 μg/kg for the five compounds, respectively. The method was successfully applied to the analysis of actual samples, and 12 compounds were checked out, which combated the illegal adulteration behavior effectively.

ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-MS/MS); illegal adulteration; weight loss compounds; foods

10.3724/SP.J.1123.2017.03007

2017-03-07

上海市科委技術(shù)平臺專項(14DZ2294000); 2016年國家食品藥品監(jiān)督管理總局食品補充檢驗方法項目.

O658

A

1000-8713(2017)06-0594-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)50798195,E-mail:jishen2013@163.com.