王亞君，翟煥趁，張帥兵，劉新影，蔡靜平

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

小麥赤霉病菌FgRab7調(diào)控Tri基因表達(dá)及DON毒素合成

王亞君，翟煥趁*，張帥兵，劉新影，蔡靜平*

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

運(yùn)用ELISA法測(cè)定了小麥赤霉病菌野生型和FgRab7敲除突變體菌株在不同基質(zhì)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素的積累情況，結(jié)果顯示，同一培養(yǎng)時(shí)期，F(xiàn)gRab7敲除突變體合成的DON毒素均顯著低于野生型菌株（P＜0.05），表明FgRab7影響DON毒素的生物合成。通過熒光定量PCR檢測(cè)了不同培養(yǎng)階段中DON生物合成相關(guān)Tri基因的表達(dá)，結(jié)果表明，Tri基因在野生型菌株中的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，在FgRab7敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量一直處于極低水平；相同的生長(zhǎng)時(shí)期，Tri基因在FgRab7敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于野生型菌株。說明FgRab7通過調(diào)控DON合成途徑相關(guān)Tri基因的表達(dá)而影響DON毒素的生物合成。

赤霉病菌；FgRab7；調(diào)控；Tri；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-4-20 14:09:27

0 前言

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (Deoxynivalenol,DON)也稱嘔吐毒素，是一種 B型單端孢霉烯族 (Trichothecene)毒素，主要由小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生[1-3]。DON毒素可抑制真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，在發(fā)生過赤霉病或其他鐮刀菌病害的谷物如小麥、玉米、大麥及其制品中普遍存在[4]，并且含有的DON毒素濃度大都超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[5-6]，這一問題已引起世界各國政府和研究者的重點(diǎn)關(guān)注。目前，DON毒素的生物合成途徑已逐步被研究清楚，一些與DON毒素生物合成相關(guān)的基因及其功能也被揭示[7-8]，如單端孢霉烯族毒素合酶（Tri5）、P450單加氧酶（Tri4）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（Tri6）[9]、15-O-乙?；D(zhuǎn)移酶（Tri3）[10]、酯酶（Tri8）、毒素輸送泵（Tri12）等，還有一些基因的功能未知，如Tri1、Tri101等。DON毒素的生物合成不僅受到物理因素和化學(xué)因素的影響，還受到一些生物大分子如cAMP、TOR、FGK3等蛋白激酶的調(diào)控[11-13]，一些小G蛋白也調(diào)控DON毒素的生物合成，如禾谷鐮刀菌Rac1（FgRac1）負(fù)調(diào)控DON的合成，而FgRho4正調(diào)控DON的合成[14]，F(xiàn)gRab7蛋白與FgRac1、FgRho4同屬于Ras超家族蛋白中的小G蛋白，且FgRab7蛋白與小麥赤霉病菌的致病性有關(guān)[15]，因此，F(xiàn)gRab7也可能調(diào)控DON毒素的合成。本研究選取小麥赤霉病菌野生型與FgRab7缺失突變體作為研究對(duì)象，測(cè)定它們?cè)诓煌囵B(yǎng)時(shí)期合成的DON量，分析DON毒素合成途徑下各Tri基因在它們生長(zhǎng)過程中的相對(duì)表達(dá)量，期望揭示小麥赤霉病菌FgRab7對(duì)DON毒素的調(diào)控機(jī)制，為從分子水平防治小麥赤霉病，控制DON毒素污染提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥赤霉病菌野生型PH-1菌株由美國普渡大學(xué)徐金榮教授惠贈(zèng)，F(xiàn)gRab7敲除突變體（△F－gRab7）和互補(bǔ)突變體（FgRab7-c）由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組研究中心惠贈(zèng)。DON毒素ELISA檢測(cè)試劑盒購自江蘇蘇微微生物研究有限公司。氯仿/異戊醇（24∶1）、酚/氯仿（25∶24）購自北京索來寶科技有限公司。RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTM、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

KMF（E 2.5）BINDER恒溫恒濕培養(yǎng)箱：德國BINDER公司；QYC-2102C搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ELx800吸收光酶標(biāo)儀、Epoch型微孔板掃描分光光度計(jì)：美國伯騰儀器有限公司；analytikjena EasyCycler PCR儀：德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；TGL-20bR高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀：Eppendorf中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥赤霉病菌FgRab7的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)小麥赤霉病菌基因組數(shù)據(jù)庫搜索FgRab7（FGSG_05141.3）的CDS序列，根據(jù)其編碼的蛋白序列在Pfam 30.0[16]Blast搜索與其同源的真核生物的蛋白序列，NCBI CDD預(yù)測(cè)這些蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Mega6.0對(duì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株的培養(yǎng)

將保存的赤霉病菌菌株野生型PH-1、FgRab7敲除突變體和互補(bǔ)突變體分別接種到CM固體培養(yǎng)基（蔗糖10 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母粉6 g/L，瓊脂粉20 g/L）上，于28℃靜置培養(yǎng)3～5 d。

（1）小麥籽粒培養(yǎng)基培養(yǎng)：裝50 g（濕質(zhì)量）滅菌麥粒于250 mL的三角瓶中，每個(gè)菌株試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，加入用滅菌的打孔器挑取的直徑為0.5 cm的菌絲5塊，每天振蕩麥粒使得赤霉病菌在小麥籽粒中發(fā)酵均勻，在28℃ 條件下培養(yǎng)35 d，分別收集培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d和35 d時(shí)的小麥籽粒樣品。

（2）產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基培養(yǎng)：用滅菌的打孔器取5塊菌絲，接種至100 mL產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基（硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵 0.01 g/L，蔗糖 30 g/L，蛋白胨10 g/L，pH為7.5）中，在28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)35 d。

1.3.3 DON毒素測(cè)定

用滅菌紗布分別過濾收集野生型菌株P(guān)H-1和FgRab7突變體菌株在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)期的菌絲，用吸水紙將菌絲吸干稱質(zhì)量，濾液用ELISA法測(cè)定細(xì)胞外的DON毒素，計(jì)算單位質(zhì)量菌絲產(chǎn)生的DON毒素量；將不同培養(yǎng)階段的小麥籽粒樣品粉碎，取5 g放置于250 mL的三角瓶中，加入25 mL去離子水，在振蕩器上充分振蕩15 min，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，常溫下5 000 r/min離心5 min，取上清液用于DON毒素的測(cè)定，DON毒素測(cè)定方法參照 ELISA試劑盒說明。

1.3.4 DON合成途徑Tri基因的熒光定量表達(dá)

將收集的培養(yǎng)不同階段的菌絲放入液氮中快速研磨，采用Takara TRizol法提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄 cDNA采用TaKaRa兩步法試劑盒 PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行，cDNA的質(zhì)量可以用小麥赤霉病菌的內(nèi)參Actin基因檢測(cè)。

根據(jù)DON合成途徑中Tri基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物（如表1），擴(kuò)增長(zhǎng)度在80～250 bp之間，引物由上海生工生物公司合成。熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL，含有SYBR Green 12.5 μL，正反向引物（10 μM）各0.5 μL，各階段模板cDNA 10 ng，加無菌水至25 μL。熒光定量PCR程序?yàn)?5℃，10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)模板稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。以小麥赤霉病菌野生型PH-1和FgRab7缺失突變體不同時(shí)期的cDNA為模板，以Tublin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值采用2-ΔΔCt法[17]進(jìn)行各基因的相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 Tri基因?qū)崟r(shí)定量PCR所用的引物序列Table 1 Tri genes primers of quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥赤霉病菌FgRab7的功能預(yù)測(cè)

為研究小麥赤霉病菌FgRab7在調(diào)控DON毒素方面的功能，我們將小麥赤霉病菌FgRab7蛋白序列在Pfam中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，獲得了部分真菌的 Rab7蛋白，這些蛋白與小麥赤霉病菌的FgRab7蛋白序列經(jīng)NCBI CDD分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gRab7編碼的蛋白都含有Ras超家族蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，因此，小麥赤霉病菌的FgRab7可能和Ras家族中Rac、Rho[14]一樣具有調(diào)控DON毒素生物合成的功能。對(duì)這些蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示（結(jié)果見圖1），它們處于3個(gè)不同分支：小麥赤霉病菌Fusarium graminearum PH-1、FgRab7蛋白與假禾谷鐮孢菌（Fusarium pseudograminearum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）Rab7蛋白聚在同一個(gè)進(jìn)化分支中，與假禾谷鐮孢菌進(jìn)化關(guān)系最近，最新研究發(fā)現(xiàn)該菌種也是小麥赤霉病的病原菌[18]，它們可能在赤霉病發(fā)生中執(zhí)行相同的生理功能；構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、青霉（Penicillium）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等具有產(chǎn)毒特性的真菌處在同一個(gè)分支，它們可能與小麥赤霉病菌中的FgRab7具有相似的功能；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）單獨(dú)處于一個(gè)分支，其為非絲狀真菌，且不產(chǎn)生毒素，與小麥赤霉病菌的FgRab7關(guān)系最遠(yuǎn)。由此推測(cè)，隨真菌的分化Rab7逐漸分化成具有調(diào)控毒素功能的基因。

圖1 小麥赤霉病菌和部分真菌物種Rab7蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Fusarium graminearum and partial fungal Rab7 protein

2.2 小麥赤霉病菌FgRab7對(duì)DON毒素合成的影響

對(duì)小麥赤霉病菌野生型和FgRab7突變體菌株的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。兩個(gè)菌株在CM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d，野生型PH-1菌株的生長(zhǎng)速率明顯高于FgRab7敲除突變體，兩者的菌落直徑相差約4倍，且野生型菌株的氣生菌絲更發(fā)達(dá)；進(jìn)一步觀察FgRab7敲除突變體互補(bǔ)菌株，發(fā)現(xiàn)其菌絲生長(zhǎng)基本恢復(fù)到野生型的水平，表明FgRab7可以影響小麥赤霉病菌的生長(zhǎng)過程。

圖2 小麥赤霉病菌野生型PH-1和FgRab7突變體菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the wild type PH-1 and the FgRab7 gene mutants

將小麥赤霉病菌野生型菌株P(guān)H-1、FgRab7敲除突變體和FgRab7互補(bǔ)突變體菌株分別接種到小麥籽粒和產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基中，ELISA法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)期的DON毒素含量,結(jié)果如圖3所示。在接種野生型菌株的小麥中，培養(yǎng)21 d時(shí)DON含量顯著升高（P＜0.05），然后以較高的速率持續(xù)產(chǎn)毒，35 d時(shí)小麥中DON含量達(dá)到1 006 mg/kg；FgRab7缺失突變體DON毒素的產(chǎn)生比較緩慢，產(chǎn)DON毒素能力顯著低于野生型菌株（P＜0.05），35 d時(shí)小麥中的DON毒素積累量?jī)H為58 mg/kg。當(dāng)在小麥中接種FgRab7互補(bǔ)突變體時(shí)，可發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)毒能力有較大程度地恢復(fù)，35 d時(shí)小麥中的DON毒素積累量達(dá)690 mg/kg。將3個(gè)不同菌株接種到液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)毒試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)毒的趨勢(shì)與在小麥基質(zhì)中完全一致。這說明FgRab7基因在DON毒素合成中有非常重要的作用。

圖3 小麥赤霉病菌野生型和FgRab7突變體在不同基質(zhì)中DON毒素的含量變化Fig.3 The production of DON by the wild type and FgRab7 mutants in different mediums

2.3 FgRab7對(duì)DON毒素生物合成途徑中Tri基因的調(diào)控

2.3.1 RNA提取

提取小麥赤霉病菌野生型PH-1和FgRab7敲除突變體在不同生長(zhǎng)時(shí)期的RNA，部分樣品電泳結(jié)果如圖4所示，28S、18S條帶清楚，表明總RNA無降解，完整性較好；測(cè)定RNA質(zhì)量濃度分別為1 764和1 179 ng/μL，260/280 OD值分別為1.97和2.05，可用于進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3.2 DON合成途徑中Tri基因的RT-PCR分析

小麥赤霉病菌DON毒素合成基因簇包括很多Tri基因，不同的基因的表達(dá)最終合成不同的DON毒素類型，如DON、3-DON、15-DON等。因此，我們?cè)谝吧途昱囵B(yǎng)7 d時(shí)的cDNA中擴(kuò)增Tri基因，結(jié)果顯示（圖5），Tri5、Tri4、Tri101、Tri11、Tri6、Tri3、Tri1和Tri8等基因都能擴(kuò)增出單一清晰的條帶，大小分別為 1 128、1 563、1 416、1 479、657、1 458、1 849、1 338 bp。這些 Tri基因在野生型PH-1菌株中是正常表達(dá)的，它們的表達(dá)決定著DON毒素的生物合成。

圖4 小麥赤霉病菌RNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis validation of RNA in the Fusarium graminearum

圖5 Tri基因在PH-1菌株cDNA中的擴(kuò)增Fig.5 The amplification of Tri genes in the PH-1 cDNA

2.3.3 Tri基因在野生型和FgRab7缺失突變體菌株中的實(shí)時(shí)定量分析

為揭示FgRab7調(diào)控DON毒素生物合成的機(jī)制，我們?cè)谛←湷嗝共【袑?duì)Tri基因在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果見圖6。由圖6可見，在野生型菌株P(guān)H-1中，各Tri基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，相同的培養(yǎng)時(shí)期，F(xiàn)gRab7敲除突變體中Tri基因的相對(duì)表達(dá)量比野生型明顯降低，這與兩種菌株中DON毒素的合成量的相對(duì)多少相吻合。在 FgRab7缺失突變體中，Tri5、Tri4、Tri101、Tri11、Tri3相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，Tri1、Tri8的表達(dá)量一直處于很低的水平。Tri1、Tri8處于DON合成途徑中Tri3基因的下游，這說明FgRab7基因的缺失對(duì)Tri基因的表達(dá)有影響，對(duì)Tri3下游基因影響最大，暗含著FgRab7通過與FgTri3基因相互作用影響其下游Tri基因的表達(dá)。在野生型菌株P(guān)H-1中，Tri5在整個(gè)培養(yǎng)期間的表達(dá)量相對(duì)較高，由于DON的合成反應(yīng)起始于法尼基焦磷酸，在Tri5編碼的trichodiene合成酶的催化作用下完成，因此，Tri5的表達(dá)影響著DON毒素的整個(gè)合成過程。Tri6是全局調(diào)控因子，當(dāng)Tri3下游基因表達(dá)降低，它將調(diào)控其上游的基因表達(dá)逐漸減弱，最終使全部Tri基因表達(dá)降低，DON毒素合成下降。因此，在小麥赤霉病菌中Rab7是通過調(diào)控與DON合成途徑直接作用的Tri基因簇的表達(dá)而影響DON合成的。

圖6 Tri基因在PH-1和FgRab7敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of Tri genes in the wild type and△FgRab7

3 結(jié)論

本研究通過預(yù)測(cè)小麥赤霉病菌FgRab7蛋白的結(jié)構(gòu)域和分析FgRab7對(duì)DON毒素生物合成和Tri基因相對(duì)表達(dá)量的影響，顯示FgRab7含有Ras超家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)gRab7的缺失使小麥赤霉病菌的DON毒素合成明顯減少，Tri基因表達(dá)量顯著下降，表明FgRab7是影響DON合成的重要因子，具有調(diào)控Tri基因簇表達(dá)和DON毒素生物合成的作用。研究結(jié)果對(duì)揭示小麥赤霉病菌的致病機(jī)制和防治小麥赤霉病具有重要指導(dǎo)意義，為更好地降低赤霉病菌毒素給食品及糧食安全帶來的風(fēng)險(xiǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

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REGULATION ON Tri RELATIVE EXPRESSION AND DON BIOSYNTHESIS OF FGRAB7 IN FUSARIUM GRAMINEARUM

WANG Yajun，ZHAI Huanchen，ZHANG Shuaibing，LIU Xinying，CAI Jingping
（School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

The production of Deoxynivalenol（DON）by wild-type Fusarium graminearum and its FgRab7 knockout mutant cultivated in different media were detected by ELISA.The results showed that the content of DON produced by FgRab7 knockout mutant was significantly less than that of wild-type F.graminearum，which indicated that the toxin-producing capability of F.graminearum was affected by FgRab7.The relative expression of Tri genes related to DON biosynthesis were analyzed in different developmental stages of the two strains through fluorescence quantitative PCR，and results showed that the expression of Tri genes rose gradually in the wild-type strain，but in a very low level in the FgRab7 knockout mutant.Compared with the wild type strain，the relative expression of Tri genes in the FgRab7 knockout mutant was significantly lower than the wild-type strain in the same growth period.The study confirmed that the FgRab7 gene could regulate the expression of Tri gene and thereby influence the biosynthesis of DON toxin.

Fusarium graminearum；FgRab7；regulation；Tri gene；deoxynivalenol

S435.121

A

1673-2383(2017)02-0057-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.020.html

2016-10-13

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB127804）；河南省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（14A180004）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（162102210191）

王亞君（1991—），女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食微生物。

*通信作者