徐 鳳，張煥容，徐桂麗，張興民，湯 承

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都 610041)

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山羊源益生芽胞桿菌的篩選

徐 鳳，張煥容*，徐桂麗，張興民，湯 承

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都 610041)

為獲得山羊源優(yōu)良益生芽胞桿菌菌株，利用剛果紅染色法對26株山羊源芽胞桿菌進行產(chǎn)纖維素酶初篩，結(jié)合濾紙酶以及羧甲基纖維素(CMC)酶活力測定進行復篩，并對其耐酸、耐膽鹽生物學特性進行研究，初步確定其益生特性，并進一步對經(jīng)上述篩選出的菌株的抑菌性以及對藥物的敏感性進行了測定。結(jié)果顯示，從26株山羊源芽胞桿菌中初篩出4株產(chǎn)纖維素酶較好的芽胞桿菌，對4株芽胞桿菌產(chǎn)酶復篩以及對酸和膽鹽的耐受性測定后，得到一株枯草芽胞桿菌，該菌株濾紙酶活為4.4 U，CMC酶活為1610 U，在pH3.0的環(huán)境中存活率大于50%，在0.3%的牛膽鹽溶液中存活率高于70%，對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，且對16種常用抗生素敏感。該株枯草芽胞桿菌X7F3可作為山羊源微生態(tài)制劑候選菌株。

山羊；芽胞桿菌；纖維素酶；耐酸；耐膽鹽；抑菌試驗；抗生素敏感性

微生態(tài)制劑作為一種新型的飼料添加劑，不僅能治療和預防疾病、提高動物生產(chǎn)性能，而且具有無污染、無殘留、無毒副作用、不產(chǎn)生耐藥等特點，是抗生素所無法比擬的[1]。短小芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌以及枯草芽胞桿菌是可添加于飼料的微生物[2]，這些芽胞桿菌是微生態(tài)制劑研究的重要菌種。芽胞桿菌在代謝過程中，可產(chǎn)生多種酶、維生素、有機酸和未知促生長因子等，參與機體新陳代謝，同時還具有競爭排斥的功能，可以減少動物胃腸道有害菌的數(shù)量，調(diào)整和維持動物消化道菌群的平衡[3]。動物胃腸道本身就有復雜的環(huán)境，其胃的酸性環(huán)境以及小腸內(nèi)膽鹽的存在對芽胞桿菌的存活具有重要的影響。然而，不同芽胞桿菌菌株產(chǎn)纖維素酶能力、對動物胃腸道環(huán)境的耐受力等卻不盡相同。因此，本試驗以26株山羊源芽胞桿菌為材料，比較研究其產(chǎn)纖維素酶的能力、耐酸能力、耐膽鹽能力、抑菌性以及藥物敏感性，旨在篩選出在動物體外具有良好益生作用的山羊微生態(tài)制劑候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來源 21株枯草芽胞桿菌、4株短小芽胞桿菌及1株地衣芽胞桿菌均為西南民族大學動物醫(yī)學實驗室自山羊瘤胃分離所得；金黃色葡萄球菌ATCC65213、大腸埃希菌ATCC25922均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；山羊源腸炎沙門菌由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆胨瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；MH購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)纖維素酶篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g/L 、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.2 g/L、NaCl 10 g/L、葡萄糖2 g/L、瓊脂20 g/L，pH為7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 2 g/L、羧甲基纖維素鈉20 g/L、酵母膏1 g/L、NaCl 3 g/L、(NH4)2SO42 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、MnSO4·H2O 0.005 g/L，以上成分混合溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.0,121℃，高壓滅菌15 min。

1.1.3 其他試劑 0.05% 苯甲酸檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 4.8)，0.36 mg/mL的葡萄糖標準溶液，0.5%剛果紅染液5% NaCl溶液脫色，3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，1%羧甲基纖維素鈉底物溶液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 moL/L，pH 4.8)；四環(huán)素、利福平、青霉素，鏈霉素、環(huán)丙沙星等16種藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌的初步篩選 將各株芽胞桿菌點種至產(chǎn)纖維素酶篩選平板上，同時點種TSA平板上作為對照，37℃恒溫培養(yǎng)24 h；用5 g/L的剛果紅染色30 min，倒掉染液并用水沖洗，加入適量50 g/L的NaCl溶液脫色60 min，測量透明圈直徑(H)、菌落直徑(C)，并計算水解圈直徑與菌落直徑大小的比值(H/C值)[4]。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌的復篩

(1)粗酶液的制備 將初篩的芽胞桿菌按1% 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，置200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中37℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液即為粗酶液，用于酶活力測定。

(2)葡萄糖標準曲線的繪制 用不同濃度的葡萄糖溶液作標準溶液，與DNS共熱反應顯色后，測出其吸光度OD值，繪制標準曲線。

(3)濾紙酶活力測定 參考文獻[5]的方法進行濾紙酶活測定，取1 mL的粗酶液于試管中，并以濾紙為底物，再加入含0.5 g/L苯甲酸鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(0.05 moL/L、pH 4.8)1.5 mL，50℃水浴平衡后，加入0.5 mL的粗酶液(不加粗酶液的為空白對照)，混勻后使試管內(nèi)的溶液沒過濾紙。50℃水浴1 h后迅速置冰上冷卻，向各試管加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，再向空白試管中加粗酶液0.5 mL，混勻并于沸水中煮10 min迅速冷卻后，用蒸餾水定容至25 mL。以不加粗酶液的試管為參照，于540 nm 波長處測定OD值，并記錄結(jié)果。濾紙酶活性單位：1 mL 粗酶液，在50℃、pH 4.8的條件下，每分鐘水解濾紙底物產(chǎn)生1μg還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量定義為1個酶活力單位(U/ mL)。

(4)CMC酶活力測定 參照文獻中DNS方法[6]，以檸檬酸-檸檬酸鈉(0.1 moL/L，pH 4.8)緩沖溶液配制成10 g/L羧甲基纖維素鈉底物溶液。取1.5 mL 的底物溶液于50℃溫浴10 min，再取0.5 mL粗酶液(不加粗酶液的為空白對照)與1.5 mL的底物溶液混合后置50℃溫浴30 min，迅速冷卻后再加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，再向空白對照試管中加入0.5 mL粗酶液。混勻后于沸水中煮10 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至10 mL。以不加粗酶液的試管為參照，于540 nm波長處測定OD值，并記錄結(jié)果。纖維素酶活力定義：在上述條件下，1 mL 粗酶液每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg還原糖的酶量，定義為1個酶活力單位(U/ mL)。

1.2.3 芽胞桿菌耐酸試驗 經(jīng)產(chǎn)酶性能篩選出的菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基于37℃擴大培養(yǎng)24 h后，充分混勻，按2% 的接種比例將菌液分別轉(zhuǎn)接至pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)4 h后。于600 nm處測OD值，設TSB液體培養(yǎng)基為調(diào)零對照。取3個重復數(shù)值并求平均值，計算細菌存活率代表菌株對酸的耐受性，存活率(%)=經(jīng)酸處理菌液OD600nm/未經(jīng)酸處理處理菌液OD600nm×100%[7]。

1.2.4 芽胞桿菌耐膽鹽試驗 經(jīng)產(chǎn)酶性能篩選出菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，充分混勻后，按2%的接種比例將上述菌液分別加到含0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%的牛膽酸鹽TSB液體培養(yǎng)基中，同2.3處理，計算存活率代表菌株對膽鹽的耐受性[7]。

1.2.5 菌株體外抑菌試驗 將待測芽胞桿菌接種于TSB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)12 h后作為種子液，再將培養(yǎng)好的種子液按2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。5000 r/ min離心10 min，取上清，備用。將各金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和山羊源腸炎沙門菌指示菌分別接種至MH液體培養(yǎng)基，200 r/min 37℃培養(yǎng)過夜，將此培養(yǎng)液按1∶100比例稀釋后取100 μL均勻涂布于MH瓊脂平板上，并將牛津杯放至平板上，每個牛津杯中加150μL芽胞桿菌培養(yǎng)上清液，于4℃冰箱擴散過夜后，37℃恒溫培養(yǎng)8 h，記錄抑菌圈直徑。

1.2.6 菌株對抗菌藥物的敏感性試驗 參照文獻[8],采用紙片擴散法法檢測芽胞桿菌對多種藥物的敏感性，從而了解該芽胞桿菌作為益生菌的安全性。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌剛果紅初篩結(jié)果

采用剛果紅染色法，對本實驗室自山羊瘤胃分離的26株芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶的情況進行了初步試驗，其結(jié)果見表1。由表1可知，26株芽胞桿菌均能產(chǎn)纖維素酶，其中H/C值在3及以上的菌株有4株，分別為枯草芽胞桿菌X7F3、枯草芽胞桿菌X7F4、枯草芽胞桿菌4F3-1、短小芽胞桿菌3F4，利用剛果紅染色法初步確定此4株芽胞桿菌中H/C值最大的為短小芽胞桿菌3F4，但其酶活性高低與H/C值是否一致還需要進一步驗證。

2.2 濾紙酶活力測定結(jié)果

(1)葡萄糖標準曲線 在濾紙酶活測定中，利用不同濃度的葡萄糖與DNS共熱反應顯色后，測定OD值，得出葡萄糖標準曲線見圖1。由標準曲線y=0.020 7x-0.004 3，R2=0.990 7，得到的標準曲線線性關(guān)系較好，可用于濾紙酶活力測定。

表1 芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶的圈菌值(H/C值)

圖1 葡萄糖標準曲線

(2)濾紙酶活力 4株芽胞桿菌在同等條件下的濾紙酶活力值及OD540 nm結(jié)果見圖2。

圖2 4株芽胞桿菌濾紙酶活力及OD540nm值

由圖可以看出，4株芽胞桿菌中濾紙酶活性由大到小依次為枯草芽胞桿菌X7F3、枯草芽胞桿菌X7F4、枯草芽胞桿菌4F3-1、短小芽胞桿菌3F4。

2.3 CMC酶活測定結(jié)果

(1) 葡萄糖標準曲線 在CMC酶活測定中，利用不同濃度的葡萄糖與DNS共熱反應顯色后，測定OD值，得出葡萄糖標準曲線見圖3。

由標準曲線y=0.006 7x-0.001 5，R2=0.991，得到的標準曲線線性關(guān)系較好，可用于CMC酶活力測定。

圖3 葡萄糖標準曲線

(2)CMC酶活力 4株芽胞桿菌在同等條件下的CMC酶活力值和OD540 nm 結(jié)果見圖4。

圖4 4株芽胞桿菌CMC酶活力值及OD540 nm 值

由圖可以看出，4株芽胞桿菌中CMC酶活由大到小依次為枯草芽胞桿菌X7F3、短小芽胞桿菌3F4、枯草芽胞桿菌X7F4、枯草芽胞桿菌4F3-1。

2.4 耐酸測定結(jié)果

益生菌進入動物體內(nèi)，需經(jīng)過胃內(nèi)酸性環(huán)境到達腸道才能發(fā)揮生物學作用，因此良好的耐酸能力是益生菌的必備條件。4株芽胞桿菌耐酸結(jié)果見圖5。

圖5 4株芽胞桿菌分離株在不同pH環(huán)境下的存活率

由圖5可知，4株芽胞桿菌在pH 3.0的環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，只有枯草芽胞桿菌X7F3的存活率在50%以上。隨著pH的升高，其成活率也逐漸升高，當pH在6.0以上時，4株芽胞桿菌存活率均在90%以上，在不同酸性條件下，枯草芽胞桿菌X7F3耐受性最好，其余3株芽胞桿菌耐受性較差。

2.5 耐膽鹽試驗結(jié)果

益生菌進入動物腸道后，會受到動物腸道內(nèi)膽汁酸鹽的抑制作用，因此益生菌必須具有較強的膽鹽耐受性。4株芽胞桿菌耐膽鹽結(jié)果見圖6。

圖6 4株芽胞桿菌分離株在不同濃度膽鹽中的存活率

由圖6可知，4株芽胞桿菌在不同濃度牛膽鹽溶液中培養(yǎng)4 h后，在0.3%的牛膽鹽溶液中的存活率均在70%以上，其中枯草芽胞桿菌X7F3在各濃度牛膽鹽溶液的存活率均高于其于3株芽胞桿菌。

2.6 抑菌試驗結(jié)果

枯草芽胞桿菌X7F3的發(fā)酵上清對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和山羊源腸炎沙門菌的抑制作用見表2。結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌X7F3發(fā)酵上清對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，而對大腸埃希菌以及山羊源腸炎沙門菌沒有抑制作用。

表2 芽胞桿菌X7F3對3種細菌的抑菌試驗結(jié)果

2.7 藥物敏感性試驗結(jié)果

枯草芽胞桿菌X7F3對9類16種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果見表3。由表3可知，枯草芽胞桿菌X7F3對以上9類16種抗菌藥物均敏感，其中對氨基糖苷類的鏈霉素以及林可胺類的林可霉素中度敏感，對其余的14種抗菌藥物高度敏感。

表3 枯草芽胞桿菌X7F3對16種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

纖維素是植物的重要組成部分，也是地球上最豐富的可再生資源[9]，充分利用植物中的纖維素并將其轉(zhuǎn)化為畜禽可利用的飼料具有重要的意義。研究證明，芽胞桿菌能分泌促進動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)降解消化的酶類，比如纖維素酶、淀粉酶等[10]。本試驗應用剛果紅染色法進行初篩，以測定酶活性進行復篩，綜合考慮水解圈和菌落直徑的比值(HC值)、濾紙酶活力以及CMC酶活力，從26株芽胞桿菌中篩選得到1株產(chǎn)纖維素酶最優(yōu)的芽胞桿菌X7F3，該菌株為枯草芽胞桿菌，其濾紙酶活為4.4 U，黃慰情[11]從堆肥樣品中分離的芽胞桿菌D-4的濾紙酶活為3.03U，兩者相比，枯草芽胞桿菌X7F3濾紙酶活較高。而湯文晶[12]從黃山森林腐木中分離的枯草芽胞桿菌的CMC酶活(586.7 U/mL)與本研究枯草芽胞桿菌X7F3的CMC酶活(1610 U/mL)相比,本研究枯草芽胞桿菌X7F3的CMC酶活較高。

動物胃腸道環(huán)境較復雜，影響益生菌存活的因素較多，如酸性環(huán)境、膽鹽環(huán)境等，因此了解益生菌在其中的生長情況對于評價該益生菌是否為優(yōu)良菌株具有重要意義。本試驗中枯草芽胞桿菌X7F3在 pH 3.0 的環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，存活率在50%以上，在0.3%的牛膽鹽溶液中培養(yǎng)4 h后的存活率均在70%以上，說明該菌株具有耐受動物胃腸道不良環(huán)境的潛力。在體外抑菌試驗中，該菌株發(fā)酵上清對大腸埃希菌以及沙門菌沒有抑菌作用，但對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌作用。

隨著抗生素在臨床抗感染治療上的廣泛使用,細菌的耐藥性問題也越來越普遍。芽胞桿菌菌株的耐藥性評價是目前國際上益生芽胞桿菌生物安全性評價的重要內(nèi)容。雖然益生菌耐藥并非絕對的有害[13]，但是對于進入動物機體的外源性活菌，其耐藥基因可能以各種方式在腸道內(nèi)微生物菌群間相互傳遞[14]。因此，對益生菌進行藥敏測試是必要的。本試驗中枯草芽胞桿菌X7F3對試驗中所用的9類16種抗菌藥物均敏感。

理想的益生菌菌株應具有準確的分類鑒定、無毒性、能在消化道目標位置存活、能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、能夠與病原菌拮抗、菌株能夠產(chǎn)生代謝活性物質(zhì)、無耐藥性、能夠調(diào)控免疫反應、能發(fā)揮促進健康作用[15]。本研究中枯草芽胞桿菌X7F3能產(chǎn)纖維素酶，且酶活力較高；對酸以及膽鹽環(huán)境有好的耐受性；發(fā)酵上清對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用；對臨床上使用使用的大多數(shù)抗生素敏感，因此初步認為該菌株在體外具有較好的益生作用。但該菌株能否調(diào)控動物機體的免疫反應、對動物機體是否產(chǎn)生毒性作用以及對是否能夠促進動物健康，需要通過動物試驗來進一步研究證實。

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Screening of ProbioticBacillusfrom Goats

XU Feng,ZHANG Huan-rong*,XU Gui-li,ZHANG Xing-min,TANG Cheng
(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China)

In order to select super probioticBacillusstrain,26Bacillusstrains isolated from goats were screened by Congo red staining method for cellulase production,filter paper enzyme activity and CMC enzyme activity of cellulase were further determined,biochemical acid resisting and bile salt resisting characteristics were studied.On this basis,the bacteriostatic and drug sensitivity of the strains were also determined.The results showed that 4Bacillusstrains have better cellulase production characteristics than the other 22Bacillusstrains,oneBacillussubtilisstrain was proved to be the best one to be used for probiotic strain with 4.4 U filter paper enzyme activity,1610 U CMC enzyme activity was over 50% survival rate under the environment for pH 3.0 and over 70% survival rate under the environment for 0.3% bile salt,thisBacillussubtilisstrain had a significant antibacterial effect onStaphylococcusaureus,and sensitive to 16 kinds of commonly used antimicrobials.These results suggest thatBacillussubtilisX7F3 was a candidate of goat probiotics strain.

goat;Bacillus; cellulase; acid tolerance; bile tolerance; bacteriostatic test; antimicrobials sensitivity

2016-08-23

國家民委科技項目(14XNZ025)；四川省教改項目“獸醫(yī)專業(yè)學位研究生教育實踐基地建設”

徐 鳳(1989-)，女(土家族)，重慶酉陽人，碩士研究生,主要從事動物醫(yī)學研究。*通訊作者

S852.616

A

1007-5038(2017)06-0043-05