劉國(guó)紅，黃 潔，劉玉雙

心脈隆注射液對(duì)酒精性心肌病大鼠心肌纖維化的影響

劉國(guó)紅，黃 潔，劉玉雙

目的 探討心脈隆注射液對(duì)酒精性心肌病大鼠心肌纖維化的影響。觀(guān)察在心脈隆治療的不同階段，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在心肌的表達(dá)情況。方法 雄性健康SD大鼠50只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，模型組酒精濃度從5%、10%、20%、30%各自由飲1周，然后濃度遞增到36%后以該濃度維持飼養(yǎng)，對(duì)照組每日飲用與酒精同等熱量的葡萄糖水，6個(gè)月后判斷心力衰竭模型是否成功。將模型大鼠隨機(jī)分為3組：心脈隆治療1 d組、心脈隆治療5 d組、心脈隆治療10 d組。予以心脈隆注射液5 mg/kg腹腔注射，用免疫組化的方法對(duì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在3組大鼠的左室心肌的分布及表達(dá)進(jìn)行半定量分析。用Masson染色法觀(guān)察3組大鼠左室心肌的膠原沉積情況。結(jié)果 隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的心肌結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)明顯減少(P<0.05)；大鼠心肌的膠原沉積明顯減少。結(jié)論 心脈隆注射液可以延緩酒精性心肌病心肌纖維化的過(guò)程。

酒精性心肌??；心脈隆注射液；心肌纖維化；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

酒精性心肌病(alcoholic Cardiomyopathy，ACM)是指長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致心肌變性、心臟擴(kuò)大和心力衰竭的一種繼發(fā)性心肌病[1]在西方，ACM是繼發(fā)性心肌病的主要類(lèi)型。我國(guó)近年來(lái)發(fā)展有增加的趨勢(shì)。一般來(lái)說(shuō)，每天飲酒80 g以上，連續(xù)10年以上，有20%～36%的人可發(fā)生酒精性心肌病。酒精性心肌病病理學(xué)特征類(lèi)似于原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病，常見(jiàn)的心肌組織改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，空泡變性和間質(zhì)水腫。變性心肌細(xì)胞內(nèi)膠原纖維減少，胞漿變稀疏，胞漿內(nèi)含大小不等的空泡，嚴(yán)重者空泡逐漸融合增大，細(xì)胞中的有形成分被溶解而留下肌膜空腔，最終形成彌漫性纖維化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(5只)、模型組(45只)。

1.2 酒精性心肌病動(dòng)物模型的建立[2]模型組依次給予質(zhì)量濃度為5%、10%、20%、30%食用酒精自由飲各1周之后，第5周開(kāi)始36%濃度酒精(滅菌水52 mL∶95%食用酒精48 mL)持續(xù)飼喂至6個(gè)月末(含酒精的飲水為唯一水源)。對(duì)照組每天給予與酒精同等熱量的葡萄糖水飲用，顆粒飼料量依據(jù)實(shí)驗(yàn)組每日食用量給予對(duì)照組相同劑量。

1.3 模型判定 在模型制作期間，每天觀(guān)察大鼠精神狀況，活動(dòng)情況，飲酒量，進(jìn)食量，大小便情況，毛色改變情況，每周稱(chēng)重一次，觀(guān)察體重變化。

1.3.1 心臟超聲心動(dòng)圖檢查 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)及功能學(xué)指標(biāo)，計(jì)量資料連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期取其平均值，用以分析。形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括：左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)、室間隔厚度(IVS)、左心室后壁收縮期厚度(LVPWTs)左心室后壁舒張期厚度(LVPWTd)。功能學(xué)指標(biāo)包括：左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)。將LVEF≤45%確定為心力衰竭模型成功。

1.3.2 HE染色組織學(xué)評(píng)價(jià)慢性心力衰竭模型是否成功 4%多聚甲醛固定48 h后，脫水，透明，浸蠟，包埋，制成4 μm的石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀(guān)察病理學(xué)變化，判定慢性心力衰竭模型是否成功。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)(采用ABC法) 4 μm石蠟切片脫蠟至水，滴加3%過(guò)氧化氫，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。滴加打孔液，以充分暴露抗原。以微波修復(fù)抗原。滴加5%BSA封閉液，37 ℃孵育40 min。滴加一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫40 min，滴加二抗，37 ℃復(fù)溫40 min。滴加鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物復(fù)合物，37 ℃孵育50 min。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，最后以蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以PBS替代一抗作陰性對(duì)照，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色光鏡下觀(guān)察 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，胞漿紋理清晰。模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)心肌纖維排列紊亂，炎細(xì)胞增多，有明顯出血壞死，心肌纖維排列呈波浪狀，甚至斷裂，炎性細(xì)胞明顯增多，出血壞死明顯。

2.2 心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變 透射電鏡下觀(guān)察可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠心肌纖維走行規(guī)則，Z線(xiàn)清晰可見(jiàn)，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)清晰，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠心肌細(xì)胞核膜明顯不規(guī)則，核仁裂解；染色質(zhì)邊集；線(xiàn)粒體數(shù)量增多、大小不等、腫脹、有空泡變性、可見(jiàn)巨線(xiàn)粒體、線(xiàn)粒體嵴融合消失，并向細(xì)胞核附近聚集；M線(xiàn)消失；肌原纖維溶解、斷裂；間質(zhì)膠原纖維增生明顯。

2.3 多普勒超聲評(píng)估(見(jiàn)表1) 與對(duì)照組相比，心衰組LVDD、LVDS顯著增加， FS、LVEF顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組左室結(jié)構(gòu)和功能的多普勒超聲檢查結(jié)果(±s)

2.4 組織學(xué)檢查 對(duì)照組心肌細(xì)胞排列齊，形態(tài)正常，胞漿紋理清晰。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌纖維排列較前整齊，出血壞死較前減少。詳見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 正常心肌HE染色(×400) 圖2 治療10 d HE染色(×400)

圖3 治療5 d HE染色(×400) 圖4 治療1 d HE染色(×400)

2.5 MASSON染色結(jié)果 對(duì)照組心肌無(wú)明顯膠原沉積。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌膠原沉積逐漸減少。詳見(jiàn)圖5～圖8。

圖5 正常心肌 Masson染色(×200) 圖6 治療 10 d Masson染色(×200)

圖7 治療5 d Masson染色(×200) 圖8 治療1 d Masson染色(×200)

2.6 免疫組化指標(biāo)測(cè)定 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在假手術(shù)組幾乎不表達(dá)，在心衰組，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，CTGF表達(dá)逐漸減少。詳見(jiàn)表2。

表2 CTGF的半定量分析(±s) 個(gè)/HP

3 討 論

CTGF是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子[3]，它能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生。可作為促纖維化的共同下游介導(dǎo)因子，在器官纖維化的發(fā)生中起著重要的作用。并通過(guò)蛋白激酶C(Protein kinase C)途徑誘導(dǎo)心肌纖維化，心力衰竭時(shí)，CTGF表達(dá)增加，CTGF扮演了一個(gè)獨(dú)立的因素，或和其他細(xì)胞因子一起誘導(dǎo)心肌纖維化和功能障礙。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是啟動(dòng)纖維化的必須因子，而不依賴(lài)于TGF-β1的CTGF持續(xù)升高是纖維化進(jìn)展的特征性表現(xiàn)[4]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)促進(jìn)膠原合成和降解，并通過(guò)血壓和神經(jīng)依賴(lài)性鈣調(diào)蛋白的途徑調(diào)節(jié)心肌纖維化[5]。并且CTGF能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的膠原合成[6]。

本實(shí)驗(yàn)采用飼喂酒精的方法，制備了發(fā)病情況與病理表現(xiàn)與人類(lèi)相似的酒精性心肌病早期心肌損傷的動(dòng)物模型，主要根據(jù)是由于乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)心肌細(xì)胞和生物膜的毒性效應(yīng)，導(dǎo)致心臟擴(kuò)大，負(fù)荷增加，最終導(dǎo)致全心衰竭，來(lái)模擬酒精性心肌病的病理改變。在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中，心室重構(gòu)是最重要的病理基礎(chǔ)，而心肌纖維化是心肌損傷及心室重構(gòu)的終末病理過(guò)程[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌纖維化得到了明顯的改善。CTGF的發(fā)現(xiàn)，為控制心肌纖維化提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。拮抗CTGF可以更專(zhuān)一的拮抗細(xì)胞增殖肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性積聚[8]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CTGF的表達(dá)比對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明CTGF可能參與了心肌纖維化的發(fā)生。

心脈隆注射液是由美洲大蠊干品經(jīng)過(guò)浸漬、減壓、濃縮、分離后得到的，有效成分為多肽、核苷及復(fù)合氨基酸，復(fù)合氨基酸起著主要的作用。核苷通過(guò)水解途徑起著輔助作用，二者缺一不可，具有利尿、增強(qiáng)心肌收縮力、減輕心臟負(fù)荷、改善心功能的作用。研究表明[9]，心脈隆注射液能有效降低老年人心衰患者的BNP水平從而改善心功能。

綜上所述，心脈隆注射液能有效地抑制心力衰竭大鼠的心肌纖維化，從而改善心室重構(gòu)，改善心功能，并且不良反應(yīng)少，是治療慢性心力衰竭的良好藥物。

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(本文編輯郭懷印)

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信息：劉國(guó)紅，黃潔，劉玉雙.心脈隆注射液對(duì)酒精性心肌病大鼠心肌纖維化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(10)：1177-1180.

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.008

1672-1349(2017)10-1177-04

2016-12-05)