秦顥誠(chéng)，武 俊*，周 盟，張宇虹，宋 宇，李潔明，溫曉娜，唐建武，冉海濤

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室 遼寧省腫瘤轉(zhuǎn)移重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116027；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010)

攜Gelsolin單抗靶向超聲造影劑的制備及體外靶向?qū)嶒?yàn)

秦顥誠(chéng)1，武 俊1*，周 盟1，張宇虹1，宋 宇1，李潔明1，溫曉娜1，唐建武2，冉海濤3

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室 遼寧省腫瘤轉(zhuǎn)移重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116027；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010)

目的 制備一種以腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)特異性膜抗原蛋白——凝溶膠蛋白(Gelsolin)為靶點(diǎn)的納米級(jí)高分子造影劑，并觀察其體外尋靶及顯影能力。方法 通過(guò)改良的雙乳化法制備高分子PLGA-COOH造影劑，以碳二亞胺法將造影劑與Gelsolin單抗連接，制備出GSN-PLGA靶向超聲造影劑。檢測(cè)該造影劑的一般性質(zhì)，評(píng)估Gelsolin單抗與造影劑表面連接情況，評(píng)價(jià)其體外尋靶能力并進(jìn)行體外顯影實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 GSN-PLGA靶向超聲造影劑平均粒徑為(575.67±4.71)nm，表面電位(-11.46±1.19)mV，造影劑表面GSN單抗結(jié)合率達(dá)96.93%。體外攝取實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞表面高表達(dá)Gelsolin抗體的小鼠腹水型肝癌高淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(Hca-F細(xì)胞)可較多攝取GSN-PLGA靶向造影劑。體外顯像實(shí)驗(yàn)顯示靶向超聲造影劑體外顯影效果較好。結(jié)論 GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與高表達(dá)Gelsolin的Hca-F細(xì)胞特異性結(jié)合，且體外顯影效果較好。

超聲檢查；造影劑；靶向；聚乳酸羥基乙酸；凝溶膠蛋白

淋巴轉(zhuǎn)移是上皮來(lái)源惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移的主要方式，與腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)，早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)對(duì)延長(zhǎng)患者生存期具有重要意義。目前常規(guī)影像學(xué)檢查主要通過(guò)腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和血流灌注特征進(jìn)行診斷，不能確切反映腫瘤的生物學(xué)行為，在腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)警及早期識(shí)別中具有明顯的局限性。既往研究[1]報(bào)道，當(dāng)小鼠肝癌淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力降低時(shí)，凝溶膠蛋白(Gelsolin)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞骨架中，而當(dāng)細(xì)胞株淋巴轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)時(shí)，其還出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。高分子聚合物聚乳酸羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid， PLGA)具有較好的生物兼容性及生物可降解性，目前已廣泛應(yīng)用于超聲造影劑微泡的制備[2]。本研究選用PLGA作為成膜材料，制備攜Gelsolin單抗的PLGA靶向高分子造影劑，并觀察其體外尋靶及顯影情況。

1 材料與方法

1.1非靶向超聲造影劑的制備 采用改良的雙乳化溶劑揮發(fā)法，精確稱取100 mg羥基端乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，聚合比50∶50)，充分溶解于 2 ml二氯甲烷中(連續(xù)相)，加入0.2 ml雙蒸水(分散相)，以VCY-500超聲波處理器(上海研永超聲設(shè)備有限公司)聲振(聲功率100 W，開4 s、關(guān)2 s，共120 s)獲得乳白色的一次乳化液，向其內(nèi)加入5 ml的4%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)溶液，繼續(xù)聲振(聲功率50 W，開4 s、關(guān)2 s，共90 s)獲得二次乳化液。而后加入20 ml的2%異丙醇溶液，于室溫下以85-2型恒溫磁力攪拌器(上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司)攪拌2～4 h，使二氯甲烷充分揮發(fā)，待微泡表面固化，以雙蒸水反復(fù)離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)后收集微泡，加入少量甘露醇并分散于1 ml雙蒸水中，冷凍干燥24～48 h后充入氟碳?xì)怏w，即獲得PLGA非靶向超聲造影劑凍干粉。

1.2靶向超聲造影劑的制備 稱取10 mg PLGA非靶向超聲造影劑，分散溶解于適量pH=5.5的MES緩沖液(濃度0.1 mol/L)中，加入適量耦聯(lián)活化劑EDC/NHS(EDC/NHS最終濃度比為2∶5)，室溫振蕩孵育30 min，以雙蒸水反復(fù)離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)，去除未反應(yīng)的EDC及NHS，再以pH=8.0的MES緩沖液(濃度0.1 mol/L)溶解活化的PLGA造影劑，加入40 μl濃度為200 μg/ml的Gelsolin單抗(終濃度為1.5 mmol/L)，室溫下振蕩孵育1～2 h，再以雙蒸水反復(fù)離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)，收集微泡，冷凍干燥24～48 h后充入氟碳?xì)怏w，即獲得GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉。

1.3靶向超聲造影劑性質(zhì)檢測(cè) 稱取20 mg的GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉充分溶解于5 ml雙蒸水中，取少量涂于載玻片上。采用Olympus BX51-P型偏光顯微鏡觀察靶向造影劑的形態(tài)、分布。另取1 ml造影劑溶液，采用Malvern 3000 SSA激光粒徑儀檢測(cè)造影劑粒徑及Zeta電位。

1.4免疫熒光法檢測(cè)GSN-PLGA表面Gelsolin單抗的連接情況 稱取100 mg PLGA-COOH和少量DiI熒光染料充分溶解于2 ml二氯甲烷中(避光條件下)，獲得DiI標(biāo)記的靶向PLGA造影劑及非靶向PLGA造影劑。分別稱取10 mg DiI標(biāo)記GSN-PLGA靶向超聲造影劑及PLGA非靶向超聲造影劑凍干粉，并以5 ml雙蒸水充分溶解，各加入20 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，于4℃振蕩2 h，以雙蒸水反復(fù)離心洗滌 (8 000轉(zhuǎn)/分)后，于Zeiss LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡下對(duì)比觀察兩種造影劑抗體連接情況，并以Beckman Coulter CytoFLEX S流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體結(jié)合率。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠腹水型肝癌高、低淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(Hca-F、Hca-P，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供)作為懸浮細(xì)胞，在含15%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中于37℃、5% CO2、完全飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)2～3代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hca-F及Hca-P細(xì)胞，離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)后收集細(xì)胞，以1×106/孔的密度接種于6孔板內(nèi)(共接種24個(gè)孔)，以不含胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)4 h后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6靶向超聲造影劑體外攝取實(shí)驗(yàn) 將上述準(zhǔn)備的細(xì)胞分為4組，每組各6個(gè)孔：Hca-F細(xì)胞非靶向PLGA組，各孔內(nèi)加入150 μl香豆素-6標(biāo)記的非靶向造影劑；Hca-F細(xì)胞抗體封閉組，先向各孔內(nèi)加入20 μl Gelsolin單抗封閉細(xì)胞表面蛋白表達(dá)，20 min后向每孔內(nèi)加入150 μl香豆素-6標(biāo)記的靶向造影劑；Hca-P細(xì)胞GSN-PLGA組和Hca-F細(xì)胞GSN-PLGA組，各孔內(nèi)均加入150 μl香豆素-6標(biāo)記的靶向造影劑。細(xì)胞吞噬造影劑后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)可發(fā)出綠色熒光。將6孔板移入孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)離心洗滌 (8 000轉(zhuǎn)/分)3次，每孔加入1 ml的4%多聚甲醛固定液固定15 min，再經(jīng)PBS離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)3次，以20 μl DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行細(xì)胞核染色，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色，而后以PBS再次離心洗滌(8 000轉(zhuǎn)/分)后收集細(xì)胞。取適量細(xì)胞于LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國(guó))下觀察各組細(xì)胞攝取造影劑情況。采用Beckman Coulter CytoFLEX S流式細(xì)胞儀測(cè)定Hca-F細(xì)胞及Hca-P細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

圖1 偏光顯微鏡下觀察，GSN-PLGA靶向超聲造影劑微泡大小均一，分散均勻(×600) 圖2 Malvern激光粒徑儀檢測(cè)GSN-PLGA靶向超聲造影劑粒徑為575.45 nm(A)，表面電位為-11.51 mV(B)

圖3 與二抗結(jié)合后GSN-PLGA靶向超聲造影劑熒光顯微鏡觀察(×400) A.DiI標(biāo)記后的造影劑發(fā)出紅色熒光； B.FITC標(biāo)記的二抗與造影劑結(jié)合后發(fā)出綠色熒光 圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)單抗連接率 A.PLGA非靶向超聲造影劑； B.GSN-PLGA靶向超聲造影劑

1.7體外顯影實(shí)驗(yàn) 稱取20 mg的GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉，以20 ml雙蒸水重懸稀釋,調(diào)整濃度至1 mg/ml、0.5 mg/ml和0.25 mg/ml，各取2 ml置于瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，另取2 ml脫氣水置于凝膠孔內(nèi)作為對(duì)照。采用百盛MyLab Twice超聲診斷儀進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，線陣探頭，頻率5～12 MHz，機(jī)械指數(shù)0.06。

2 結(jié)果

2.1靶向高分子造影劑的一般性質(zhì) GSN-PLGA靶向超聲造影劑外觀為白色粉末狀，水溶性好，顯微鏡下觀察造影劑復(fù)溶后大小均一，形態(tài)規(guī)則，分散均勻(圖1)，平均粒徑為(575.67±4.71)nm(圖2A)，造影劑表面電位為(-11.46±1.19)mV(圖2B)。

2.2靶向造影劑表面Gelsolin單抗連接情況 DiI標(biāo)記的GSN-PLGA靶向超聲造影劑表面Gelsolin一抗與FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗連接后，DiI發(fā)出紅色熒光(圖3A)，結(jié)合二抗的微泡發(fā)出綠色熒光(圖3B)。而DiI標(biāo)記的非靶向PLGA超聲造影劑僅可見紅色熒光，未見綠色熒光。流式細(xì)胞儀測(cè)得PLGA非靶向超聲造影劑熒光抗體(單抗)結(jié)合率為0.73%(圖4A)，GSN-PLGA靶向超聲造影劑熒光抗體(單抗)結(jié)合率為96.93%(圖4B)。

2.3靶向超聲造影劑體外尋靶能力 Hca-F細(xì)胞非靶向PLGA組、Hca-F細(xì)胞抗體封閉組、Hca-P細(xì)胞GSN-PLGA組及Hca-F細(xì)胞GSN-PLGA組的平均熒光強(qiáng)度分別為(108.39±1.29)、(123.31±1.25)、(140.15±0.98)、(189.09±1.14)，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6741.287，P<0.001)。兩兩比較，Hca-F細(xì)胞GSN-PLGA組熒光強(qiáng)度高于其他3組(P均<0.05)；Hca-F細(xì)胞抗體封閉組及Hca-P細(xì)胞GSN-PLGA組的熒光強(qiáng)度均高于Hca-F細(xì)胞非靶向PLGA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。體外攝取實(shí)驗(yàn)激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)見圖5，Hca-F細(xì)胞非靶向PLGA組及Hca-F細(xì)胞抗體封閉組細(xì)胞僅攝取極少量的造影劑，表現(xiàn)為微弱的綠色熒光。細(xì)胞表面高表達(dá)Gelsolin蛋白的Hca-F細(xì)胞可攝取更多GSN-PLGA靶向造影劑，其綠色熒光較細(xì)胞表面低表達(dá)Gelsolin蛋白的Hca-P細(xì)胞更強(qiáng)(圖5G、5I)，即該靶向造影劑針對(duì)Gelsolin靶點(diǎn)的靶向性較強(qiáng)。

圖5 激光共聚焦顯微鏡圖(×400) A～C.Hca-F細(xì)胞非靶向PLGA組； D～F.Hca-F細(xì)胞抗體封閉組； G～I(xiàn).Hca-P細(xì)胞GSN-PLGA組； J～L.Hca-F細(xì)胞GSN-PLGA組 (圖A、D、G、J為細(xì)胞攝取造影劑后細(xì)胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光；圖B、E、H、K為經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光；圖C、F、I、L為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核合并圖像)

2.4體外顯影效果 GSN-PLGA靶向超聲造影劑體

圖6 不同濃度下GSN-PLGA靶向超聲造影劑及脫氣水體外顯影情況 A.1 mg/ml； B.0.5 mg/ml； C.0.25 mg/ml； D.脫氣水

外顯影效果見圖6，造影劑回聲均勻細(xì)膩，后方回聲無(wú)衰減，且隨造影劑濃度增加造影效果更優(yōu)。

3 討論

超聲造影在腫瘤的診斷和鑒別診斷方面發(fā)揮著重要作用。但非靶向的超聲造影劑屬于血池顯像，不能透過(guò)血管內(nèi)皮間隙滲透至腫瘤組織內(nèi)，因此不能獲得腫瘤的特異性成像，在對(duì)良惡性腫瘤的鑒別方面具有局限性。研究[3]報(bào)道，腫瘤血管內(nèi)皮間隙可允許直徑<700 nm的微粒穿過(guò)。因此，通過(guò)改進(jìn)超聲造影劑的成膜材料，制備納米級(jí)超聲造影劑，使其直徑<700 nm，便可穿越腫瘤組織血管內(nèi)皮間隙到達(dá)腫瘤靶區(qū)。如將納米級(jí)超聲造影劑與腫瘤相關(guān)抗原單克隆抗體或特異性配體連接，可在體內(nèi)識(shí)別并結(jié)合腫瘤組織表面的特異性分子，實(shí)現(xiàn)造影劑在腫瘤組織中的主動(dòng)靶向富集，從而提高超聲對(duì)腫瘤早期診斷的特異性。

自超聲造影劑問(wèn)世以來(lái)，微泡成膜材料和填充氣體不斷改進(jìn)，超聲造影劑的體積逐漸減小，顯影效果逐步提高。隨著近年高分子化學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用高分子材料與空氣或其他難溶性氣體制備出的微泡超聲造影劑具有微泡均勻度好，體內(nèi)穩(wěn)定性高，體內(nèi)外存留時(shí)間長(zhǎng)、抗壓力性能好，聲衰減微弱等特點(diǎn)[4-5]。PLGA是一種新型的成膜材料，具有生物兼容性及可降解性，用其制備的納米微泡不僅可包載化療藥物，還能夠與表面帶有氨基的單克隆抗體、配體、各種特異性短肽等活性物質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵耦聯(lián)在一起，且性質(zhì)穩(wěn)定，是理想的超聲造影劑材料[6-8]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良雙乳化法制備的納米級(jí)超聲造影劑微泡大小較均一，形態(tài)規(guī)則，分散均勻，體外顯影效果亦較好。

淋巴轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因之一，及早診斷并及時(shí)治療有助于延長(zhǎng)腫患者的生存期并提高生存質(zhì)量。既往腫瘤超聲分子成像和靶向治療研究主要是針對(duì)腫瘤新生血管及腫瘤細(xì)胞的成像和抑制，目前血管外分子靶點(diǎn)的特異性成像已成為研究熱點(diǎn)。有研究[9]報(bào)道，Gelsolin是一種重要的骨架調(diào)節(jié)蛋白，在Ca2+依賴下調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架actin的聚合和解聚，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)，在細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Gelsolin的高表達(dá)在部分腫瘤中可增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞偽足形成的頭端，Gelsolin能夠通過(guò)支架蛋白R(shí)ACK1與整合素αvβ3結(jié)合并形成黏著斑，促進(jìn)細(xì)胞局部的形變；在細(xì)胞遷移的尾端，Gelsolin能夠通過(guò)支架蛋白R(shí)ACK1實(shí)現(xiàn)黏著斑的解聚，使細(xì)胞間的黏附性降低，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移[10-11]。研究[12]報(bào)道，通過(guò)shRNA干擾下調(diào)Gelsolin在具高淋巴道轉(zhuǎn)移力的Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)，不僅可明顯降低Hca-F細(xì)胞體外遷移和侵襲能力，還可降低體內(nèi)淋巴結(jié)黏附能力，表明Gelsolin基因有促進(jìn)淋巴道轉(zhuǎn)移的作用。Abbeele等[13]在對(duì)Hela、MDA-MB231和PC-3細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)，干擾下調(diào)Gelsolin蛋白表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力也隨之降低。本研究通過(guò)碳二亞胺法將Gelsolin單抗成功耦聯(lián)于PLGA納米微泡，制備攜Gelsolin單抗的高分子造影劑，此方法是利用PLGA-COOH中羧基與Gelsolin單抗中的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合[14]，連接不易斷裂。本研究體外尋靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與細(xì)胞表面高表達(dá)Gelsolin的小鼠肝癌高淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合。

綜上所述，本研究制備的GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與高表達(dá)Gelsolin的Hca-F細(xì)胞特異性結(jié)合，且體外顯影效果亦較好。相信該靶向超聲造影劑今后將有望為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的分子顯像提供新的助力，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警。

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Prepartation of Gelsolin-targeted ultrasound contrast agent and experiment in vitro

QINHaocheng1，WUJun1*，ZHOUMeng1，ZHANGYuhong1，SONGYu1,LIJieming1，WENXiaona1，TANGJianwu2，RANHaitao3

(1.DepartmentofUltrasound，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China；2.DepartmentofPathology,DalianMedicalUniversity，KeyLaboratoryforTumorMetastasisofLiaoningProvince,Dalian116027,China; 3.DepartmentofUltrasound，theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400010，China)

Objective To prepare a kind of Gelsolin-targeted ultrasound contrast agent (GSN-PLGA) and to explore its targeting and imaging effection in vitro. Methods The high molecular PLGA-COOH ultrasound contrast agents were prepared by a modified double emulsion technique and then conjugated with Gelsolin monoclonal antibody by carbodiimide technique. The physical property of contrast agent was determined. And the connectivity condition of ultrasound contrast agent with Gelsolin monoclonal antibody was estimated. The targeting ability and the effect of enhancing ultrasound imaging in vitro were explored. Results The average diameter of GSN-PLGA was (575.67±4.71)nm. The potential was (-11.46±1.19) mV. And the binding rate of Gelsolin monoclonal antibody was 96.93%. In vitro experimentshowed more GSN-PLGA could be intaked by Hca-F cells and the ultrasound imaging cloud be enhanced greatly. Conclusion The GSN-PLGA nanoparticle can bind to Hca-F cells specifically and can enhance the ultrasound imaging greatly.

Ultrasonography； Contrast media； Target； Poly lactic-co-glycolic acid； Gelsolin

國(guó)家自然科學(xué)基金(81501476)、遼寧省自然科學(xué)基金(214023001)。

秦顥誠(chéng)(1990—)，男，江蘇連云港人，在讀碩士。研究方向：腫瘤分子顯像與靶向治療。E-mail： 351518028@qq.com

武俊，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，116027。E-mail: wujun108@sina.com

2016-09-03

2017-02-25

R445.1; R-332

A

1003-3289(2017)06-0826-06

10.13929/j.1003-3289.201609013