田 芳

(雅培貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200213)

嬰幼兒配方粉及成人營(yíng)養(yǎng)品中脂肪酸含量檢測(cè)方法的性能研究

田 芳

(雅培貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200213)

目的：建立適用于嬰幼兒配方粉及成人營(yíng)養(yǎng)品中脂肪酸檢測(cè)的方法，并在不同基質(zhì)中驗(yàn)證其性能。方法：在AOAC 2012.13方法基礎(chǔ)上進(jìn)一步修改建立了直接甲酯化法，并對(duì)其檢測(cè)嬰幼兒配方食品及成人營(yíng)養(yǎng)品中主要功能性脂肪酸的能力進(jìn)行驗(yàn)證。方法驗(yàn)證包括其準(zhǔn)確性、回收率、精確度及定量限。本實(shí)驗(yàn)還研究了此方法在7種不同基質(zhì)(乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方)嬰幼兒配方粉中的適用性，并與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB 5413.27-2010檢測(cè)4種脂肪酸的能力進(jìn)行了比對(duì)。同時(shí)，還評(píng)價(jià)了此方法檢測(cè)包埋DHA原料的能力。結(jié)果：直接甲酯化法表現(xiàn)出了良好的準(zhǔn)確性、回收率及精確度，在不同基質(zhì)及使用不同包埋工藝的DHA原料中均顯示了很好的適用性。此方法與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法測(cè)定7種乳粉試樣中的4種脂肪酸的結(jié)果一致性均在90%～106%范圍內(nèi)，表現(xiàn)出了很高的一致性。結(jié)論：直接甲酯化法預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、方便、快捷，作為乳粉樣品中脂肪酸含量的日常檢測(cè)方法具有較大的推廣潛力及價(jià)值。

直接甲酯化法；乙酰氯甲醇法；脂肪酸；方法性能；乳粉；包埋DHA

多不飽和脂肪酸花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)對(duì)嬰幼兒的大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及成人的代謝和心血管健康都起到至關(guān)重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)嬰幼兒配方粉及成人營(yíng)養(yǎng)品中脂肪酸含量的方法主要有GB 5413.27—2010 “嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定”[1]及AOAC 2012.13“毛細(xì)管氣相色譜檢測(cè)乳制品及嬰幼兒配方食品中的標(biāo)簽脂肪酸的含量”[2]。國(guó)標(biāo)一法乙酰氯甲醇法使用外標(biāo)法定量，實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果偏差較大，且試劑乙酰氯為強(qiáng)腐蝕試劑，不利于操作人員及環(huán)境的健康。AOAC 2012.13為直接甲酯化法，待測(cè)樣品不需經(jīng)過脂肪提取，使用相對(duì)溫和的甲醇鈉甲醇溶液對(duì)甘油三酯上的脂肪酸直接進(jìn)行水解甲酯化，并使用十一碳脂肪酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)在AOAC 2012.13方法基礎(chǔ)上，并參考了Cantellops等的研究成果[3]建立了直接甲酯化法，為了更好的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程的影響因素，選擇了十三碳甘油三酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。對(duì)所建立的直接甲酯化法的準(zhǔn)確度、回收率、精確度及定量限(LOQ)進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)此方法在不同基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品中的適用性及檢測(cè)包埋DHA的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試劑

氨水(28%～30%)、甲醇鈉甲醇溶液(0.5mol/L)，購(gòu)于Sigma-Aldrich；氯化鈉及乙酰氯，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲基叔丁基醚(MTBE)、甲醇及正己烷均為色譜純，購(gòu)于Thermo-Fisher。

十一碳酸甘油三酯、十三碳酸甘油三酯、十八碳二烯酸甘油三酯、十八碳三烯酸甘油三酯、二十碳四烯酸甘油三酯、二十二碳六烯酸甘油三酯及脂肪酸甲酯混標(biāo)(40種，GLC 617)，均購(gòu)于Nu-Chek Prep.。

1.2 樣品

質(zhì)控樣：NIST SRM 1849a；乳粉樣品：7種。試樣1、2、3、4為乳基嬰幼兒配方粉；試樣5：含大豆蛋白的較大嬰兒及幼兒配方粉；試樣6：含部分水解蛋白的嬰幼兒配方粉；試樣7：含全水解蛋白的嬰幼兒配方粉；試樣1～7均為雅培中試試驗(yàn)樣品。包埋DHA樣品：2種。試樣8：BASF包埋DHA，由BASF公司提供；試樣9：Kievit包埋DHA，由Friesland Campina Kievit公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀(具有氫火焰離子檢測(cè)器，F(xiàn)ID)：安捷倫7890 B；毛細(xì)管色譜柱：SUPELCO 2560，100 m × 0.25 mm，0.2 μm；離心機(jī)：ThermoFisher Scientific Heraeus Multifuge X3R；漩渦振蕩器：Fisher Scientific；恒溫水浴，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；分析天平(精確至0.1 mg)：Mettler Toledo MS 304S。

1.4 方法

1.4.1 直接甲酯化法 本實(shí)驗(yàn)室在AOAC 2012.13方法基礎(chǔ)上建立了直接甲酯化法，用于檢測(cè)嬰幼兒配方粉及其它乳品中各脂肪酸組分的含量。稱取一定量的樣品(乳粉0.2 g、液態(tài)乳1 g)于50 mL玻璃離心管中，加入1 mL水充分溶解(液態(tài)乳可跳過此步)，加入5 mL十三碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液(2.0 mg/mL于MTBE)，混勻后再加入5 mL甲醇鈉甲醇溶液(0.5mol/L)，旋緊蓋子，充分振搖，室溫下靜置3.5 min進(jìn)行水解甲酯化。之后再依次加入2 mL正己烷及5 mL飽和氯化鈉溶液，漩渦振搖30 s，2 000r/min離心5 min，取上層清液有機(jī)相進(jìn)行GC分析。

1.4.2 乙酰氯甲醇法 本研究中使用的乙酰氯甲醇法是在國(guó)標(biāo)GB/T 5413.27—2010方法一的基礎(chǔ)上稍做修改。乙酰氯與甲醇反應(yīng)得到的鹽酸—甲醇使試樣中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化，用正己烷提取后，經(jīng)氣相色譜儀分離檢測(cè)，外標(biāo)法定量。本方法只適用于水份含量低于5%的試樣中脂肪酸組分的分析，所以本研究中只用此方法檢測(cè)了乳粉樣品。準(zhǔn)確稱取適量的乳粉樣品(0.25 g)于螺口玻璃反應(yīng)瓶中，加入3 mL 10% 乙酰氯甲醇溶液，并充分混勻。將反應(yīng)瓶放入80oC恒溫水浴中反應(yīng)2 h，期間每15 min取出振搖1次。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液取出冷卻至室溫，加入2.5 mL正己烷并充分渦旋30 s，然后加入2.5 mL飽和氯化鈉溶液并充分混勻。將試樣液3 000 r/min離心5 min，取上層清液有機(jī)相進(jìn)行GC分析。將十八碳二烯酸甘油三酯、十八碳三烯酸甘油三酯、二十碳四烯酸甘油三酯及二十二碳六烯酸甘油三酯溶于正己烷中配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)過與試樣相同的預(yù)處理過程，進(jìn)行GC分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 色譜條件 色譜柱：SUPELCO 2560，100 m × 0.25 mm，0.2 μm；載氣：氦氣；載氣流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：20∶1；檢測(cè)器溫度：250℃；柱溫箱溫度：初始溫度100℃，持續(xù)13 min；以10℃ /min 升至 180℃，保持 6 min；以1℃/min升溫速率升至200℃，保持20 min；以4℃/min升至 230℃，保持10.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接甲酯化法的單實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證

2.1.1 準(zhǔn)確性 通過檢測(cè)NIST SRM 1849a試樣來驗(yàn)證直接甲酯化法的準(zhǔn)確性。乳粉檢測(cè)中重點(diǎn)關(guān)注的4種脂肪酸：亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA中，NIST SRM 1849a認(rèn)證證書提供了亞油酸及α-亞麻酸的證書值。所以，本研究通過對(duì)比NIST SRM 1849a中亞油酸及α-亞麻酸的10次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的平均值與其各自的證書值[4]，來驗(yàn)證直接甲酯化法的準(zhǔn)確性。

使用直接甲酯化法測(cè)定NIST SRM 1849a中亞油酸及α-亞麻酸的10次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果見表1，此2種人體必需脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的認(rèn)證值范圍之內(nèi)，說明直接甲酯化具有很好的準(zhǔn)確性。

表1 直接甲酯化法測(cè)定NIST SRM 1849a中亞油酸及α-亞麻酸的結(jié)果及與證書值的比較

注：所有結(jié)果均表示為g脂肪酸每100 g樣品。

2.1.2 回收率 選用脫脂乳粉為“空白”基質(zhì)，其四種脂肪酸的本底的測(cè)定值見表2。為便于計(jì)算，之后所有的脂肪酸的測(cè)定值均表示為g 脂肪酸甲酯每100g 樣品。

表2 空白基質(zhì)脫脂乳粉中亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA的含量

注：a所有的脂肪酸的測(cè)定值均表示為g 脂肪酸甲酯每100g 樣品；b脫脂乳粉中未檢出DHA。

本研究對(duì)含量較低的α-亞麻酸、ARA及DHA的回收率做了進(jìn)一步的研究。使用α-亞麻酸甘油三酯、花生四烯酸甘油三酯及二十二碳六烯酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并于脫脂乳粉中進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)試。每種脂肪酸均做3個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)回收測(cè)試：α-亞麻酸為0.01、0.05、0.10 g/100g；ARA及DHA為0.002、0.01、0.02 g/100g。每個(gè)加標(biāo)水平做3個(gè)平行，測(cè)試結(jié)果見表3。

表3 直接甲酯化法測(cè)定乳粉中α-亞麻酸、ARA及DHA含量的加標(biāo)回收率

注:所有的脂肪酸的測(cè)定值均表示為g 脂肪酸甲酯每100g 樣品。

表3結(jié)果顯示，α-亞麻酸、ARA及DHA在3個(gè)加標(biāo)水平的回收率均在90%～110%之間，且3個(gè)平行的RSD均小于10%，說明直接甲酯化法測(cè)定乳粉中的脂肪酸含量具有很好的回收率。

2.1.3 精密度 本研究對(duì)直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA含量的精密度也進(jìn)行了驗(yàn)證。每種脂肪酸，對(duì)含有3個(gè)不同濃度水平的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，每個(gè)濃度水平獨(dú)立測(cè)定6次(表4)。

表4 直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中不同濃度水平的亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA含量的精密度

注: 所有的脂肪酸的測(cè)定值均表示為g 脂肪酸甲酯每100g 樣品。

由表4的結(jié)果可知，使用直接甲酯化法檢測(cè)3個(gè)不同含量水平脂肪酸的樣品時(shí)，每個(gè)濃度水平獨(dú)立測(cè)定6次的RSD值均小于10%，顯示此方法具有很好的精密度。

2.1.4 定量限 使用脫脂乳粉為空白基質(zhì)，在定量限LOQ水平進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，3次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的回收率用于評(píng)價(jià)確定方法檢測(cè)4種脂肪酸的定量限。

由表5的結(jié)果可知，亞油酸和α-亞麻酸在0.01 g/100g的加標(biāo)水平的回收率均在90%～110%之間，ARA及DHA在0.002 g/100g加標(biāo)水平的回收率也均在90%～110%之間。故直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中亞油酸和α-亞麻酸的定量限為0.01 g/100g乳粉，ARA及DHA的定量限為0.002 g/100g乳粉。

表5 直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA含量的定量限

注：所有的脂肪酸的測(cè)定值均表示為g 脂肪酸甲酯每100g 樣品。

2.2 直接甲酯化法與乙酰氯甲醇法對(duì)不同基質(zhì)樣品測(cè)定結(jié)果的比較

7種不同基質(zhì)的嬰幼兒配方乳粉(乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方)被選做試驗(yàn)樣品，來進(jìn)一步評(píng)價(jià)直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中主要脂肪酸的性能，并與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB 5413.27—2010方法1的測(cè)定結(jié)果作比較。顯著性分析(t檢驗(yàn)，α=0.05)結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定7種乳粉試樣中的亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA的結(jié)果均無顯著性差異(P>0.05)，表現(xiàn)出了很高的一致性。表6結(jié)果還顯示，直接甲酯化內(nèi)標(biāo)法與國(guó)標(biāo)外標(biāo)法相比，在測(cè)定四種脂肪酸尤其是微量脂肪酸ARA和DHA時(shí)，總體表現(xiàn)出了較高的精密度。

2.3 直接甲酯化法對(duì)包埋DHA試樣的測(cè)定

目前市售的乳粉中，很多產(chǎn)品使用包埋DHA原料對(duì)DHA的含量進(jìn)行強(qiáng)化。我們從中國(guó)市場(chǎng)包埋DHA原料市場(chǎng)占有率最大的2個(gè)原料供應(yīng)商BASF及Friesland Campina Kievit取得試樣，來評(píng)價(jià)直接甲酯化法測(cè)定包埋DHA的性能。表7結(jié)果表明，直接甲酯化法可以檢測(cè)到原料中90%以上的包埋DHA，可以用于含有包埋DHA乳粉樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究在AOAC 2012.13乳粉中脂肪酸檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上稍做修改，建立了直接甲酯化法檢測(cè)乳粉中主要脂肪酸含量的方法。直接甲酯化法表現(xiàn)出了很好的準(zhǔn)確性、回收率及精確度。該方法在乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方乳粉中均有很好的適用性，其4種主要脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果與GB方法高度一致。并且，此方法對(duì)目前中國(guó)市場(chǎng)中市場(chǎng)份額占有率較大的2種包埋DHA原料中DHA的檢測(cè)均適用。本研究的結(jié)果表明基于AOAC 2012.13建立的直接甲酯化法具有很好的性能及較廣的產(chǎn)品適用性，且操作簡(jiǎn)單快捷，作為乳粉樣品及原料中脂肪酸含量的日常檢測(cè)方法具有較大的推廣潛力及價(jià)值。◇

表6 乙酰氯甲醇法及直接甲酯化法測(cè)定不同基質(zhì)乳粉中的亞油酸、α-亞麻酸、ARA及DHA的結(jié)果比較

注：a試樣S1-S4為乳基嬰兒配方粉、S5為含大豆蛋白的較大嬰兒配方粉、S6為含部分水解蛋白的嬰兒配方粉、S7為氨基酸配方粉。所有試樣均為雅培中試試驗(yàn)樣品；b4種脂肪酸的測(cè)定結(jié)果均表示為3次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表7 直接甲酯化法測(cè)定包埋DHA原料中的DHA含量

注：所有結(jié)果均表示為g脂肪酸每100g樣品。

[1]GB/T 5413.27-2010.Determination of Fatty Acids in Foods for Infants and Young Children，Milk and Milk Products[S]. National Standards of the People’s Republic of China (嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定.中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)).

[2]AOAC Official Method 2012.13.Determination of Labeled Fatty Acids Content in Milk Products and infant Formula Capillary Gas Chromatography[S]. First Action 2012.

[3]Cantellops D，Reid A P，Eitenmiller R R，Long A R.Determination of Lipids in Infant Formula Powder by Direct Extraction Methylation of Lipids and Fatty Acid Methyl Esters(FAME)Analysis by Gas Chromatography[J]. J.AOAC Int.，1999，82(5)：1128-1139.

[4]Certificate of Analysis of Standard Reference Material 1849a[S]. National Institute of Standards & Technology，2012：1-12.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Performance of Testing Methods of Fatty Acids in Infant Formula and Adult Nutritional Products

TIAN Fang

(Abbott Nutrition R&D, Shanghai 200233, China)

direct transesterification；acetyl chloride-methanol method；fatty acid；method performance；milk powder；encapsulated DHA

田芳(1985— )，女，博士，分析研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)品中營(yíng)養(yǎng)素及污染物的分析。