張猛++王瓊++萬東光++余向陽

摘要：為篩選新的防治西瓜枯萎病的生防菌菌種資源，采用稀釋涂布平板法從番茄植株中分離得到對西瓜枯萎病菌具有顯著抑制作用的拮抗菌，采用平板對峙法研究其對病原菌的廣譜抑制效果，將菌體特征結(jié)合16S rDNA序列分析及生理生化指標(biāo)相結(jié)合，對生防菌進(jìn)行初步鑒定，明確其分類地位，并采用溫室栽培試驗(yàn)對其進(jìn)行抗病效果初探。結(jié)果表明，從番茄中分離的1株對西瓜枯萎病菌具有顯著拮抗作用的菌株wm005，對西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黃瓜立枯病菌、草莓灰霉病菌、小麥赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻惡苗病菌、葡萄炭疽病菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用，具有廣譜抗性。根據(jù)菌體特征、16S rDNA序列分析及生理生化指標(biāo)的結(jié)果，初步鑒定該菌為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis wm005）。溫室栽培試驗(yàn)表明菌株wm005對由西瓜枯萎病菌引起的西瓜枯萎病具有顯著的防治效果（防效為75.1%），高出化學(xué)藥劑百菌清防效16.9百分點(diǎn)，說明菌株Bacillus vallismortis wm005具有很好田間應(yīng)用開發(fā)的潛力。

關(guān)鍵詞：死谷芽孢桿菌；分離；生防菌；西瓜枯萎病

中圖分類號： S436.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0097-04

植物病害一直是威脅農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)的重要因素，化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用一方面使得病原菌產(chǎn)生了抗藥性，另一方面對人、畜和環(huán)境產(chǎn)生危害，由農(nóng)藥引起的食品安全問題已經(jīng)受到廣泛關(guān)注[1]。因此，采用高效、低毒、環(huán)境友好的治理技術(shù)來替代傳統(tǒng)單一依靠化學(xué)農(nóng)藥來防治植物病害是生產(chǎn)中亟待解決的問題。生物防治因其對環(huán)境和人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性、處理費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)林病蟲害的防治[2，4]。生物防治（Biological Control）是指利用生物物種間的相互關(guān)系，以一種或一類生物抑制、消滅另一種或一類有害生物的防治方法[5-6]。在生物防治過程中，分離和篩選防效好、活性穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的可替代化學(xué)試劑的生防菌株資源是保證生物防治效果的前提[7]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是指某一時(shí)期生活在活的植物組織內(nèi)而不引起明顯病害癥狀，并與寄主和諧共存的細(xì)菌。植物內(nèi)生菌作為最具防病潛力與應(yīng)用價(jià)值的一類生防細(xì)菌，不僅能夠促進(jìn)植物生長，增加作物的產(chǎn)量，還能提高植株抗病能力，對植物本身而言也不是一個(gè)外來物種，從而成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)對象[8]。有資料顯示，目前在各種農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細(xì)菌已超過129種，分屬于54個(gè)屬，主要為芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、泛菌屬（Pantoea）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等[9]，為植物病害的生物防治提供了豐富的微生物資源。近年來內(nèi)生菌領(lǐng)域的研究已取得一定進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些有醫(yī)用、農(nóng)用價(jià)值的菌株和化合物[10]。

本研究從番茄中分離篩選到1株對西瓜枯萎病菌具有顯著抑制作用的拮抗菌，并結(jié)合菌體特征、16S rDNA序列分析及生理生化指標(biāo)，對拮抗菌進(jìn)行初步鑒定，確定其分類地位。同時(shí)，在溫室盆栽條件下對分離的拮抗菌進(jìn)行抗病效果初探，旨在為生物防治提供菌種資源。1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試致病菌株西瓜枯萎病菌（Fusarium oxyporum f. sp. niveum）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院產(chǎn)地環(huán)境研究室保存。試驗(yàn)中選用的西瓜品種為江蘇省江蔬種苗科技有限公司培育的“蘇蜜5號”。菌株培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖糖培養(yǎng)基（PDB）和Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）。菌株DNA提取、PCR擴(kuò)增試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

試驗(yàn)儀器為：超凈臺（蘇州凈化），搖床（上海知楚），PCR儀（Eppendorf），掃描電鏡（蔡司EVO18）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離、純化與保存該菌株分離自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜基地大棚內(nèi)的番茄植株。采集番茄樣品后，自來水洗風(fēng)干，然后依次用75%乙醇浸泡1 min和8% NaClO浸泡4 min進(jìn)行表面消毒處理，無菌水洗4次后，將根、莖、葉用無菌剪刀剪開，根和莖切成約1 cm的小段，放置于LB平板上；葉加水研磨至糊狀，靜置10 min后涂布LB平板，均放置于30 ℃培養(yǎng)48 h，選取不同形態(tài)特征的單菌落反復(fù)平板劃線純化后進(jìn)行斜面保存。

1.2.2拮抗菌的篩選及廣譜性驗(yàn)證采用對峙培養(yǎng)法篩選出對西瓜枯萎病病原菌具有抑制作用的菌株。首先，將尖孢鐮刀菌在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)5 d，用直徑為5 mm的打孔器在平板上打取圓形瓊脂塊，將其接入PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)2 d，然后用滅菌牙簽在病原菌菌餅兩側(cè)等距離處點(diǎn)接種分離得到的細(xì)菌，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察記錄抑菌圈。每個(gè)處理重復(fù)3次，有抑菌圈的菌株即為拮抗菌。為進(jìn)一步驗(yàn)證分離的菌株對植物土傳病害是否具有廣譜抑菌效果，選取了如表1所示的另外6種常見的植物病原真菌進(jìn)行進(jìn)一步的抑菌試驗(yàn)。

1.2.3拮抗菌的鑒定形態(tài)學(xué)觀察：將分離菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征。采用結(jié)晶紫進(jìn)行革蘭氏染色，并利用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)及大小。掃描電子顯微鏡（SEM）樣品制備過程參見林英等的方法[11]略作調(diào)整。固定：取液體培養(yǎng)基中的菌體1 mL，4 000 r/min離心20 min，棄上清，并用生理鹽水清洗3次，倒入2.5%戊二醛固定液于4 ℃過夜后，用生理鹽水清洗3次。脫水：依次用30%、50%、70%、85%、90%的乙醇溶液梯度脫水處理，各濃度均處理15 min。再用100%的乙醇處理2次，每次 15 min。干燥：吸取混勻的細(xì)菌-醋酸戊脂懸浮液滴在蓋玻片上，將滴有菌液的蓋玻片分別于-70 ℃的冰箱冷凍12 h后，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥。掃描：將干燥后的樣品放在真空鍍膜機(jī)內(nèi)鍍金15 min后取出在掃描電鏡中進(jìn)行觀察。

生理生化特征分析：37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，生理生化特征按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[12]進(jìn)行鑒定。

1.2.4拮抗菌的16S rRNA序列測定采用常規(guī)小量基因組提取方法，采用TaKaRa MiniBEST Bacterical GenomicDNA Extraction Ver. 2.0試劑盒，根據(jù)細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以過夜培養(yǎng)的wm005菌體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR運(yùn)行程序：預(yù)變性 94 ℃，10 min；變性94 ℃，45 s；退火56 ℃，40 s；延伸72 ℃，40 s，共35個(gè)循環(huán)；總延伸72 ℃，7 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條約1 400 bp的特異性片段，樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5盆栽試驗(yàn)盆栽試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院日光溫室內(nèi)進(jìn)行。將西瓜枯萎病菌在PDA平板上培養(yǎng)6～7 d，用孔徑為20 mm的打孔器在培養(yǎng)基上打孔，取10片帶菌培養(yǎng)基加入200 mL滅菌綠豆湯培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d，用滅菌紗布（4層）過濾去渣，濾液于4 ℃、5 000 r/min 下離心10 min，去上清液取沉淀物（西瓜枯萎病菌分生孢子），用液體馬鈴薯培養(yǎng)基重懸后，用滅菌去離子水稀釋使孢子濃度為1×107個(gè)/mL，28 ℃孵育60 min，然后將西瓜枯萎病菌的分生孢子液與滅菌的基質(zhì)（營養(yǎng)土 ∶蛭石=1 ∶1）混合均勻，接種量為106個(gè)分生孢子/g基質(zhì)，制成病土。將西瓜種子表面消毒后，無菌水浸泡過夜，30 ℃恒溫催芽2 d。露白后播種于穴盤，待小苗長至2片真葉時(shí)，移栽至內(nèi)徑10 cm、高15 cm、內(nèi)裝300 g病土壤的塑料杯中。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，即拮抗細(xì)菌菌株wm005培養(yǎng)液（1×108 CFU/mL）、75%百菌清可濕性粉劑稀釋500倍液（有效成分 1 500 mg/L）、對照LB空白培養(yǎng)液，每處理12株西瓜苗，3次重復(fù)。在移栽的同時(shí)，各處理分別在每株西瓜苗根部灌澆 10 mL 拮抗細(xì)菌菌株wm005培養(yǎng)液，以后每隔5 d灌澆1次，連續(xù)3次。在最后1次施藥后第21天按照于思勤等的分級標(biāo)準(zhǔn)[13]調(diào)查西瓜苗發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)與防治效果。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA過程進(jìn)行Duncans多重比較，檢驗(yàn)組間差異顯著性。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的分離及廣譜性驗(yàn)證

通過平板對峙法對分離的細(xì)菌進(jìn)行篩選，得到1株對西瓜枯萎病菌具有明顯拮抗活性的菌株，將其命名為wm005。對菌株wm005進(jìn)行抗菌譜測定，發(fā)現(xiàn)菌株wm005對油菜菌核病菌、黃瓜立枯病菌和草莓灰霉病菌具有非常強(qiáng)烈的抑制效果，且菌株wm005對小麥赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻惡苗病菌、葡萄炭疽病菌表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用。由此可見菌株wm005在離體平板試驗(yàn)條件下對植物病原菌具有廣譜的抑菌效果。

2.2拮抗菌鑒定

2.2.1形態(tài)特征供試菌株wm005為革蘭氏陽性菌株，其電鏡照片見圖1，菌體呈桿狀、無鞭毛、兩端鈍圓，能夠產(chǎn)生橢圓形芽孢，長1.2～2.2 μm，寬0.6～0.8 μm。該菌株在LB培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h后，菌落呈乳白色，邊緣不規(guī)則，表面干澀易起皺、易挑起。能在25～40 ℃的溫度下生長，最適生長溫度為32 ℃；生長pH值范圍為4.0～9.0；最適pH值為6.5。生理生化測定結(jié)果（表2）表明，接觸酶反應(yīng)、V.P.試驗(yàn)、硝酸鹽還原反應(yīng)、石蕊牛奶還原胨化、淀粉水解反應(yīng)、利用檸檬酸鹽反應(yīng)、葡萄糖酸鹽、吲哚試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)、氧化酶試

2.2.216S rDNA序列分析菌株wm005經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增后，得到了1條約1 400 bp的目的條帶，將目的片段膠回收后測序，為長度1407bp的DNA序列。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中采用Blast進(jìn)行同源性比對（序列登記號為：KX094443），結(jié)合MEGA 6.0用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），wm005與Bacillus vallismortis同屬1個(gè)遺傳分支，親緣性達(dá)到99%。結(jié)合形態(tài)特征觀察以及生理生態(tài)特征分析，確定菌株wm005為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis wm005）。

2.3盆栽試驗(yàn)

由表3可知，從番茄中分離的拮抗菌wm005在溫室條件下對西瓜枯萎病菌引發(fā)的枯萎病有一定的防治效果，從病情指數(shù)上來看，接種菌株wm005的西瓜植株病情指數(shù)17.2，明顯低于沒有接種菌株wm005。只接種西瓜枯萎病菌的對照試驗(yàn)組（70.2），病情指數(shù)下降53。從防治效果來看，菌株

3結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的生物防治是引入一個(gè)新生物來控制植物有害生物，但是多數(shù)難以取得成功，這是因?yàn)橐粋€(gè)新物種的進(jìn)入必然涉及到未知的風(fēng)險(xiǎn)。因此，客觀地評估生物防治中的新物種對環(huán)境及其他物種帶來的潛在危害至關(guān)重要[14]。植物內(nèi)生細(xì)菌能夠促進(jìn)植物生長、增加作物的產(chǎn)量，還能提高植株抗病能力，對植物本身而言也不是一個(gè)外來物種，不存在上述潛在的危害，因此作為生防細(xì)菌具有巨大的防病潛力和重要的應(yīng)用價(jià)值。國內(nèi)外關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害報(bào)道很多。van Buren等從馬鈴薯莖組織中分離得到61株內(nèi)生菌對馬鈴薯環(huán)腐病有防治效果[15]。Ren等在楊樹干中發(fā)現(xiàn)的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）對楊樹潰瘍病菌有抑制作用，還對植物生長可以起到促進(jìn)作用[16]。龍良鯤等從番茄根內(nèi)篩選到18株內(nèi)生細(xì)菌，在番茄的根部具有較強(qiáng)的定殖能力，在盆栽試驗(yàn)中對番茄青枯病菌具有一定的拮抗作用[17]。楊海蓮等報(bào)道水稻苗期根內(nèi)分離的陰溝腸桿菌（Enterobater cloacae），對水稻白葉枯病菌不表現(xiàn)體外拮抗作用，但是用其發(fā)酵液噴霧或浸種，都可以顯著提高水稻對白葉枯病的抗性[18]。本試驗(yàn)從番茄植株中分離到1株對西瓜枯萎病菌具明顯拮抗作用的內(nèi)生菌株wm005，根據(jù)菌體特征、16S rDNA序列分析及生理生化指標(biāo)，初步鑒定該菌為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis wm005）。

芽孢桿菌可產(chǎn)生肽類、脂肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類、核酸類等抗菌物質(zhì)，不同種類的抗菌物質(zhì)有不同的生物學(xué)活性，因此芽孢桿菌往往表現(xiàn)出對多種病害的廣譜抗性。采用平板對峙試驗(yàn)對該菌株進(jìn)行抗菌譜測定，結(jié)果表明菌株wm005對西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黃瓜立枯病菌、草莓灰霉病菌、小麥赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻惡苗病菌、葡萄炭疽病菌均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用。由此可見菌株wm005對植物病原菌具有廣譜的抑菌效果。

研究表明，很多生防菌在平板對峙試驗(yàn)中對病原菌表現(xiàn)出良好抑制效果，但是在植物活體或田間試驗(yàn)中卻沒有理想的防效[19-21]。在本試驗(yàn)中，內(nèi)生生防細(xì)菌wm005不僅對西瓜枯萎病菌以及其他病原菌表現(xiàn)出了廣譜的抑菌效果，而且在溫室盆栽試驗(yàn)中，對西瓜枯萎病菌引起的西瓜枯萎病也具有較好的防治效果。但是由于實(shí)際田間環(huán)境相對溫室條件而言要復(fù)雜得多，植物內(nèi)生生防細(xì)菌wm005在田間實(shí)際應(yīng)用中的防治效果還需要進(jìn)一步研究。

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