王沖，郭懷祖

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不同細(xì)胞系表達(dá)的抗EGFR單抗糖基化結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

王沖1，郭懷祖2

1 上海藥品審評(píng)核查中心，上海 201203 2 抗體藥物與靶向治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

王沖, 郭懷祖. 不同細(xì)胞系表達(dá)的抗EGFR單抗糖基化結(jié)構(gòu)對(duì)比分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 1018–1027.Wang C, Guo HZ. Characterization of N-glycosylation in an anti-EGFR monoclonal antibody produced by different expression systems. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 1018–1027.

真核表達(dá)系統(tǒng)造就了單克隆抗體藥物的廣泛異質(zhì)性，這些異質(zhì)性通常是由翻譯后修飾引起，而糖基化修飾則是關(guān)鍵的翻譯后修飾，其對(duì)治療性蛋白的安全性和有效性有著深遠(yuǎn)的影響，為探索細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的改變對(duì)單抗糖基化所帶來(lái)的影響，應(yīng)用液相色譜-電噴霧離子化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) (LC-ESI-Q-Tof)，通過(guò)交替高低碰撞能量掃描、源內(nèi)誘導(dǎo)解離及二級(jí)質(zhì)譜的方法從釋放的寡聚糖水平研究聚糖結(jié)構(gòu)，對(duì)比分析由兩種不同細(xì)胞系制備的抗表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR) 單抗，然后結(jié)合外切糖苷酶逐級(jí)消化的方法對(duì)兩種蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步確證分析。分析結(jié)果表明，在Fc區(qū)域的糖基化修飾，兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的該抗體未發(fā)生明顯的改變，而在Fab區(qū)域，由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備的抗EGFR單抗的聚糖結(jié)構(gòu)中含有大量α半乳糖(α-Gal)，且末端唾液酸形式主要是N-羥乙基神經(jīng)氨酸 (NGNA)，具有極高的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。而通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO表達(dá)系統(tǒng)制備的抗EGFR單抗Fab區(qū)域聚糖結(jié)構(gòu)中不含有α-Gal，且末端唾液酸形式主要是N乙酰神經(jīng)氨酸 (NANA)，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)極大降低。本研究在一定程度上可以預(yù)測(cè)由CHO 表達(dá)系統(tǒng)制備的抗EGFR單抗具備較好的臨床耐受性，超敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)低，CHO細(xì)胞可以作為該抗體改良型生物類似藥 (Biobetter) 的優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)。

細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，糖基化，α半乳糖，免疫原性

糖基化是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾。蛋白質(zhì)分子表面的糖鏈可對(duì)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，糖基化作為重要的翻譯后加工過(guò)程，對(duì)蛋白質(zhì)的正確折疊、定位、免疫原性以及生物學(xué)活性有很大的影響[1]。單克隆抗體的糖基化聚糖結(jié)構(gòu)與抗體效應(yīng)功能之間密切相關(guān)，F(xiàn)c段作為單抗的效應(yīng)功能區(qū)與FcRs結(jié)合發(fā)揮抗體依賴細(xì)胞毒 (ADCC) 作用、激活Clq發(fā)揮補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒 (CDC) 作用、與新生兒受體 (Neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn) 結(jié)合介導(dǎo)清除作用，糖基化修飾通過(guò)影響功能區(qū)的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)ADCC、CDC以及半衰期[2]。糖基化作用還會(huì)影響單抗的安全性，特別是非人源聚糖，具有潛在的免疫原性[3]。特別是存在于 Fab功能區(qū)的聚糖可以同時(shí)影響此類藥物的安全性和有效性特征，某些情況下還可以影響單抗的聚集性[4]。糖基化修飾高度依賴于細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和亞克隆選擇，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的諸多因素，如培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件均會(huì)影響糖基化[5]，進(jìn)而影響治療性蛋白的生物學(xué)活性、療效、免疫原性以及藥代動(dòng)力學(xué)[6-7]。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese hamster ovary，CHO)和小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (NS0，SP2/0) 表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為當(dāng)前治療性抗體和Fc-融合蛋白的金標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已批準(zhǔn)上市的治療性單抗中，48%表達(dá)于CHO細(xì)胞、而45%表達(dá)于鼠源細(xì)胞 (21% NS0細(xì)胞、14% SP2/0細(xì)胞、10%雜交瘤細(xì)胞)。盡管多肽鏈的完整性在不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)條件下一般不會(huì)發(fā)生變化，但翻譯后修飾特別是糖基化類型以及比例的重大改變?nèi)圆蝗莺鲆昜9]。

Cetuximab (商品名Erbitux?)，是一種特異性靶向細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR) 的重組人鼠嵌合單克隆抗體，被多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌治療。然而有研究報(bào)道，該藥在臨床應(yīng)用中超敏反應(yīng)發(fā)生率極高，大多數(shù)發(fā)生超敏反應(yīng)的患者血清中存在藥物特異性的IgE抗體，該IgE抗體特異性抗α-Gal[10]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Erbitux?由哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0) 培養(yǎng)制備獲得，這種鼠源細(xì)胞系含有一種額外的α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶，主要介導(dǎo)半乳糖殘基從α構(gòu)象的UDP-Gal轉(zhuǎn)移到末端半乳糖殘基上，進(jìn)而生成α-Gal。α-Gal是一種不良的非人類二糖，發(fā)現(xiàn)存在于某些單抗的聚糖上，特別是鼠源細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)的單抗中[11-13]。某些患者體內(nèi)存在高水平的抗α-Gal IgE抗體，如果使用聚糖中含有α-Gal單元的單抗進(jìn)行治療，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO糖基化的機(jī)制同人類的IgG糖基化機(jī)制作用十分相似，早期研究認(rèn)為CHO細(xì)胞缺乏合成含有α-Gal表位糖蛋白的生物合成機(jī)制[14]，新近研究報(bào)道CHO細(xì)胞中存在α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，但在克隆選擇過(guò)程中此基因處于無(wú)表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)[15]，α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因在CHO細(xì)胞系中的激活機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能同其他糖苷轉(zhuǎn)移酶相似，與轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)[16]。而對(duì)于Cetuximab在兩種表達(dá)系統(tǒng)中的糖型研究的報(bào)道還比較少，正是基于此，我們選擇CHO表達(dá)系統(tǒng)制備出和Cetuximab一致氨基酸序列的抗 EGFR 單抗，從而用于評(píng)估抗EGFR單抗在兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)中的糖基化差異。在糖基化修飾的評(píng)估中，我們應(yīng)用液相色譜-電噴霧離子化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) (LC-ESI-Q-Tof)，通過(guò)交替高低碰撞能量掃描、源內(nèi)誘導(dǎo)解離及二級(jí)質(zhì)譜的方法在游離寡聚糖水平研究聚糖結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行對(duì)比分析，并結(jié)合外切糖苷酶逐級(jí)消化的方法對(duì)兩種不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗的糖鏈結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步確證分析。結(jié)構(gòu)解析證實(shí)由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備的Erbitux?(以下簡(jiǎn)稱Cetuximab-SP2/0) 的聚糖結(jié)構(gòu)中含有大量α-Gal，且末端唾液酸形式主要是NGNA，具有極高的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。而通過(guò)CHO表達(dá)系統(tǒng)制備的抗EGFR單抗 (以下簡(jiǎn)稱Cetuximab-CHO) 的聚糖結(jié)構(gòu)中未檢出α-Gal，且糖鏈末端唾液酸形式主要是NANA，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)極大降低。隨著Cetuximab-CHO進(jìn)一步的臨床開發(fā)，可在大規(guī)模的臨床試驗(yàn)中予以進(jìn)一步驗(yàn)證，有望為潛在的超敏反應(yīng)患者帶來(lái)最大的益處，同時(shí)Cetuximab-CHO有望成為一種改良型生物類似藥，而CHO細(xì)胞具有作為該抗體改良型生物類似藥優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

氨水、乙酸、甲醇購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑公司；乙腈(ACN, MS級(jí))、甲酸(FA, MS級(jí)) 購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；碘化鈉、亮氨酸腦啡肽、血纖肽、DTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超純水 (18.2M) 取自Millipore公司Milli-Q系統(tǒng)；PNGase F、Endo F2購(gòu)自上海邁泰君奧生物技術(shù)有限公司；α-galactosidase購(gòu)自Megazyme，Erbitux?購(gòu)自Merck KgaA公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Agela SPE-01自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)、固相萃取柱Cleanert HILIC柱購(gòu)自天津艾杰爾公司；Sephadex G-25 Fine脫鹽膠及XK26/40柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；Amide柱 (Acquity UPLC BEH)、質(zhì)譜儀(Xevo G2 QTof)、數(shù)據(jù)處理軟件 (Biopharmalynx)、超高效液相色譜系統(tǒng) (Acquity UPLC) 購(gòu)自美國(guó)Waters公司；SORVALL RC-6離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；真空凍干機(jī) (CHRIST真空凍干機(jī)) 購(gòu)自德國(guó)Christ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取兩個(gè)蛋白樣品各1.0 mg，在20 mmol/L PB pH 7.0的緩沖液中分別加入糖苷酶PNGase F、EndoF2及α-galactosidase，37 ℃水浴24 h，分別取上述酶切產(chǎn)物，加入3倍體積冰乙醇，冰浴20 min，13 000 r/min高速離心5 min，棄沉淀，取上清，凍干。將凍干好的各寡糖樣品，在30 %醋酸+70 % DMSO反應(yīng)體系中進(jìn)行2-AB標(biāo)記寡糖，65 ℃避光干浴3–4 h后終止。以HILIC固相萃取柱脫鹽，同時(shí)去除過(guò)量的2-AB。ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1 mm×100 mm正相柱，柱后質(zhì)譜分析。液相條件：0–40 min，流動(dòng)相 50 mmol/L甲酸胺，流速為0.5 mL/min，柱溫保持在60 ℃。Ion Mode離子化模式ESI+，質(zhì)譜掃描范圍(/)：50–4 000。

2 結(jié)果與分析

單抗在糖苷酶作用下得到游離糖鏈，經(jīng)熒光標(biāo)記后分別通過(guò)LC/MS、MS/MS及寡糖外切酶分析。研究結(jié)果表明，兩種不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗均具有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，且均發(fā)生了糖基化；兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)，其Fc段上的糖鏈種類及比例未發(fā)生明顯的變化，均以G0F、G1F以及G2F為主，符合CHO細(xì)胞的常見(jiàn)糖型[17]；但在Fab區(qū)域的糖基化修飾，兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的抗EGFR抗體的糖鏈結(jié)構(gòu)具有顯著的差別，不僅糖型比例具有差異性，在糖型的種類上也具有顯著差異。由CHO表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗Fab段上的糖鏈結(jié)構(gòu)以唾液酸NANA為主，且糖鏈不含有α-Gal；而SP2/0表達(dá)系統(tǒng)的單抗Fab段上的糖鏈結(jié)構(gòu)以唾液酸NGNA為主，且糖鏈含有大量的α-Gal。

2.1 LC/MS分析重鏈Fc段的糖鏈結(jié)構(gòu)

重鏈Fc段上的寡糖經(jīng)糖苷酶PNGase F酶切獲得 (在非變性的條件下，Cetuximab Fab區(qū)域的糖基化修飾由于空間位阻不能被PNGase F酶切，僅有Fc區(qū)域的糖基化可以被PNGase F酶切)，酶切下來(lái)的糖鏈用2-AB進(jìn)行標(biāo)記 (還原胺化) 后經(jīng)過(guò)UPLC HILIC柱液相分離，進(jìn)入熒光檢測(cè)器。通過(guò)串聯(lián)的質(zhì)譜，正離子模式下使2-AB標(biāo)記的寡糖離子化后帶正電荷，進(jìn)行質(zhì)譜分析測(cè)定各寡糖峰的質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步定性。

如圖1所示，兩種不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的抗EGFR單抗的重鏈Fc段上具有相同的糖鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有相似的各糖型組分比例，在高甘露糖 (Man5) 的比例上，Cetuximab-CHO含量更少，提示其具有更小的免疫原性及血漿清除風(fēng)險(xiǎn)[18]。主要為9種主要的寡糖：G0F-GlcNAc、G0、G0F、Man5、(1,6)G1、(1,3)G1、(1,6)G1F、(1,3)G1F以及G2F。重鏈Fc段上的各寡糖色譜峰保留時(shí)間幾乎完全一致，各寡糖實(shí)測(cè)分子量幾乎完全一致，并且同理論質(zhì)量一致。

總之，通過(guò)LC/MS方法初步表明兩種不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗的重鏈Fc段上具有相同的糖鏈結(jié)構(gòu)，均為巖藻糖化的復(fù)雜型雙觸角結(jié)構(gòu)，以2個(gè)、1個(gè)、0個(gè)3種半乳糖存在形式為主，符合文獻(xiàn)報(bào)道的Fc段N-糖的特征[19]。

2.2 LC/MS分析重鏈Fab段的糖鏈結(jié)構(gòu)

重鏈Fab段上的寡糖可以在非變性情況下經(jīng)糖苷酶EndoF2酶切獲得，酶切下來(lái)的糖鏈用2-AB進(jìn)行標(biāo)記 (還原胺化) 后經(jīng)過(guò)UPLC HILIC柱液相分離，進(jìn)入熒光檢測(cè)器。通過(guò)串聯(lián)的質(zhì)譜，正離子模式下使2-AB標(biāo)記的寡糖離子化后帶正電荷，進(jìn)行質(zhì)譜分析測(cè)定各寡糖峰的質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步定性。

如圖2所示，Cetuximab-SP2/0的重鏈Fab段上主要為8種主要的寡糖：G0(F)、(1,6)G1(F)、(1,3)G1(F)、G2(F)、G2(F)+αGal、G2(F)+2αGal、G2(F)+αGalNGNA以及G2(F)+2NGNA. Cetuximab- CHO的重鏈Fab段上則主要為6種主要的寡糖：G0(F)、(1,6)G1(F)、(1,3)G1(F)、G2(F)、G2(F)+NANA以及G2(F)+2NANA。兩種不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗重鏈Fab段上的各寡糖實(shí)測(cè)質(zhì)量均與理論分子量一致。

總之，通過(guò)LC/MS方法檢測(cè)，初步表明兩種不同的細(xì)胞系統(tǒng)制備的單抗重鏈Fab段上具有不同的糖鏈結(jié)構(gòu)，由CHO表達(dá)系統(tǒng)制備的單抗Fab段上的糖鏈結(jié)構(gòu)以唾液酸NANA為主，且糖鏈不含有α-Gal；而SP2/0表達(dá)系統(tǒng)的單抗Fab段上的糖鏈結(jié)構(gòu)以唾液酸NGNA為主，且糖鏈含有大量的α-Gal、NGNA和α-Gal均為非人寡糖，具有較大的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，特別是α-Gal處在Fab區(qū)域時(shí)，其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)更大，而在Fc區(qū)域時(shí)由于空間位阻效應(yīng)，其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)則比較低[20]。

2.3 寡糖外切酶分析重鏈Fab段的糖鏈結(jié)構(gòu)

上述研究結(jié)果初步表明，Cetuximab-CHO單抗Fab段上的糖鏈不含有α-Gal，而Cetuximab-SP2/0單抗Fab段上的糖鏈含有大量的α-Gal。本研究中，在通過(guò)糖苷酶切獲得重鏈Fab段上的寡糖基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用寡糖外切酶α半乳糖苷酶，酶切產(chǎn)物用2-AB進(jìn)行標(biāo)記 (還原胺化) 后經(jīng)過(guò)UPLC HILIC柱液相分離，進(jìn)入熒光檢測(cè)器。通過(guò)串聯(lián)的質(zhì)譜，正離子模式下使2-AB標(biāo)記的寡糖離子化后帶正電荷，進(jìn)行質(zhì)譜分析測(cè)定各寡糖峰的質(zhì)量，通過(guò)對(duì)比分析α半乳糖苷酶切前后的各寡糖峰的變化對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步定性，以進(jìn)一步確證Cetuximab-SP2/0單抗中α-Gal的存在及Cetuximab-CHO單抗中α-Gal的缺失。

如圖3所示，Cetuximab-SP2/0單抗Fab段上的寡糖在經(jīng)過(guò)α半乳糖苷酶切前后，其各寡糖峰發(fā)生了變化，含有α-Gal的寡糖因丟失了末端α-Gal而導(dǎo)致寡糖峰消失。其中，G2(F)+αGal和G2(F)+2αGal寡糖在α半乳糖苷酶的作用下丟失了末端α半乳糖，變成G2(F)，因此，在α半乳糖苷酶切后，G2(F)+αGal和G2(F)+2αGal寡糖峰消失，而G2(F)寡糖峰峰高增加；而G2(F)+αGalNGNA寡糖在α半乳糖苷酶的作用下丟失了末端α半乳糖，變成G2(F)+NGNA，因此，在α半乳糖苷酶切后，G2(F)+αGalNGNA寡糖峰消失，而出現(xiàn)G2(F)+NGNA這個(gè)新的寡糖峰(圖4)。

圖4 熒光色譜圖積分法定量對(duì)比分析Cetuximab-SP2/0重鏈Fab段上的寡糖經(jīng)α半乳糖苷酶處理前后的相對(duì)比例

同樣，采用α半乳糖苷酶對(duì)Cetuximab-CHO 單抗Fab段上的寡糖進(jìn)行處理。如圖5所示，Cetuximab-CHO單抗Fab段上的寡糖在經(jīng)過(guò)α半乳糖苷酶切前后，其各寡糖峰沒(méi)有發(fā)生明顯的糖型種類變化 (圖6)。說(shuō)明在Cetuximab-CHO上不存在可檢測(cè)的α-Gal修飾。總之，通過(guò)寡糖外切酶α半乳糖苷酶的方法進(jìn)一步表明：Cetuximab-CHO單抗Fab段上的糖鏈不含有α-Gal，而Cetuximab-SP2/0單抗Fab段上的糖鏈含有大量的α-Gal。

圖6 熒光色譜圖積分法定量對(duì)比分析Cetuximab-CHO重鏈Fab段上的寡糖經(jīng)α半乳糖苷酶處理前后的相對(duì)比例

3 討論

ESI-MS和MALDI-MS質(zhì)譜方法常常用于寡糖結(jié)構(gòu)的分析，并且通常與UPLC、HPLC、CE等分離技術(shù)相串聯(lián)[21]。為了進(jìn)一步確證寡糖的結(jié)構(gòu)信息，如連接、分支、差向異構(gòu)等，通過(guò)MS/MS獲得寡糖的碎片信息以及寡糖外切酶法均被廣泛應(yīng)用于寡糖的結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域[22-23]。本研究分別通過(guò)LC/MS及寡糖外切酶法對(duì)比分析兩種不同的細(xì)胞系表達(dá)抗EGFR抗體的重鏈Fc段和Fab段上的寡糖結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步探索細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的改變對(duì)單抗Fc區(qū)域以及Fab區(qū)域糖基化所帶來(lái)的影響。研究表明不同的表達(dá)系統(tǒng) (SP2/0和CHO) 對(duì)于抗EGFR單抗Fc區(qū)域糖型的影響顯著性不大，而Fab區(qū)域的糖型發(fā)生了顯著性改變，非人類二糖α-Gal寡糖以及唾液酸NGNA大量存在于SP2/0細(xì)胞表達(dá)的單抗中，而CHO細(xì)胞表達(dá)的單抗中未發(fā)現(xiàn)α-Gal寡糖及NGNA，僅存在唾液酸NANA。

另外，鼠源細(xì)胞系糖基化同人IgG糖基化的不同之處在于，一方面具備產(chǎn)生α-Gal表位的蛋白生物合成機(jī)制[24]，另一方面鼠源細(xì)胞系產(chǎn)生NGNA，而并不是產(chǎn)生NANA。NGNA和NANA的區(qū)別是NGNA有1個(gè)額外的氧原子，并且，糖蛋白中若含有NGNA殘基，被認(rèn)為與其在人體中的免疫原性密切相關(guān)[25]。一些已上市的治療型糖蛋白因?yàn)楹蠳GNA殘基而在病人體內(nèi)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。本研究通過(guò)對(duì)比研究表明由SP2/0細(xì)胞表達(dá)的單抗末端唾液酸以異常的唾液酸NGNA為主，而由CHO細(xì)胞表達(dá)的單抗末端唾液酸以正常唾液酸NANA為主。

關(guān)于通過(guò)SP2/0作為細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的抗EGFR單抗的結(jié)構(gòu)研究，Qian等應(yīng)用oMALDI Qq-TOF MS的方法對(duì)Erbitux?的寡糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行具體的表征，研究結(jié)果表明其寡糖結(jié)構(gòu)多樣，含有不同程度的唾液酸NGNA和α-Gal[26]。Ghaderi等研究結(jié)果證實(shí)了該單抗中NGNA的存在，并發(fā)現(xiàn)來(lái)自正常人血清中的抗NGNA抗體能夠與單抗發(fā)生NGNA特異性反應(yīng)并在體外產(chǎn)生免疫復(fù)合物；通過(guò)給NGNA合成缺陷的小鼠體內(nèi)注射該單抗，小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生抗NGNA抗體，并且體內(nèi)循環(huán)抗NGNA抗體能夠促進(jìn)藥物清除。Yang等通過(guò)對(duì)該單抗電荷異質(zhì)性的研究中發(fā)現(xiàn)其含有NGNA和α-Gal。本研究中關(guān)于由小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備的抗EGFR單抗的糖基化研究結(jié)果同文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

本研究開發(fā)了一套有效的方法通過(guò)LC/MS及寡糖外切酶法對(duì)比分析兩種不同細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的抗體重鏈Fc段和Fab段上的寡糖結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明由CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的抗EGFR單抗Fc區(qū)域的糖型種類及比例和SP2/0差異性不大，高糖甘露糖型比例稍低；但對(duì)于Fab區(qū)域的糖型影響較大，主要為不含有α-Gal寡糖結(jié)構(gòu)，且末端唾液酸以正常唾液酸NANA為主?？贵w的結(jié)構(gòu)與功能是不可分的兩個(gè)方面，在CHO細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的該單抗產(chǎn)物Fab糖基化修飾 (糖鏈結(jié)構(gòu)) 的不同也許會(huì)導(dǎo)致它們的功能不同，特別是其抗原性發(fā)生巨大差別直至影響其安全性和有效性，從糖型的類型來(lái)看，其改變是朝著降低免疫原性的方向進(jìn)行，但最終還是要靠臨床結(jié)果來(lái)檢驗(yàn)。目前CHO細(xì)胞表達(dá)的該藥物正處在臨床試驗(yàn)階段，安全性和有效性的確切結(jié)果還有待最終的臨床結(jié)論予以進(jìn)一步確證，其有望為潛在的超敏反應(yīng)患者帶來(lái)益處，同時(shí)Cetuximab-CHO有望成為一種改良型生物類似藥，而CHO細(xì)胞則具有作為該抗體改良型生物類似藥優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)的潛力，該系統(tǒng)也可以應(yīng)用于其他改良型生物類似藥的開發(fā)。

[1] Zhang PQ, Woen S, Wang TH, et al. Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs. Drug Discov Today, 2016, 21(5): 740–765.

[2] Higel F, Seidl A, S?rgel F. N-glycosylation heterogeneity and the influence on structure, function and pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc fusion proteins. Eur J Pharm Biopharm, 2016, 100: 94–100.

[3] Batra J, Rathore AS. Glycosylation of monoclonal antibody products: current status and future prospects. Biotechnol Prog, 2016, 32(5): 1091–1102.

[4] Courtois F, Agrawal NJ, Lauer TM, et al. Rational design of therapeutic mAbs against aggregation through protein engineering and incorporation of glycosylation motifs applied to bevacizumab. MAbs, 2016, 8(1): 99–112.

[5] Zhu JW. Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production. Biotechnol Adv, 2012, 30(5): 1158–1170.

[6] Pacis E, Yu M, Autsen J, et al. Effects of cell culture conditions on antibody-linked glycosylation-what affects high mannose 5 glycoform. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(10): 2348–2358.

[7] Hossler P, Khattak SF, Li ZJ. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology, 2009, 19(9): 936–949.

[8] Beck A, Wagner-Rousset E, Bussat MC, et al. Trends in glycosylation, glycoanalysis and glycoengineering of therapeutic antibodies and Fc-fusion proteins. Curr Pharm Biotechnol, 2008, 9(6): 482–501.

[9] Kunert R, Reinhart D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(8): 3451–3461.

[10] Chung CH, Mirakhur B, Chan E, et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-α-1,3-galactose. N Eng J Med, 2008, 358(11): 1109–1117.

[11] Galili U. The α-gal epitope (Galα1-3 Galβ1-4GlcNAc-R) in xenotransplantation. Biochimie, 2001, 83(7): 557–563.

[12] Dor FJMF, Cheng J, Alt A, et al. Gal1,3Gal expression on porcine pancreatic islets, testis, spleen, and thymus. Xenotransplantation, 2004, 11(1): 101–106.

[13] Magnusson S, M?nsson JE, Strokan V, et al. Release of pig leukocytes during pig kidney perfusion and characterization of pig lymphocyte carbohydrate xenoantigens. Xenotransplantation, 2003, 10(5): 432–445.

[14] Jenkins N, Parekh RB, James DC. Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol, 1996, 14(8): 975–981.

[15] Bosques CJ, Collins BE, Meador JW, et al. Chinese hamster ovary cells can produce galactose-α-1,3- galactose antigens on proteins. Nat Biotechnol, 2010, 28(11): 1153–1156.

[16] Potvin B, Kumar R, Howard DR, et al. Transfection of a human alpha-(1,3)fucosyltransferase gene into Chinese hamster ovary cells. Complications arise from activation of endogenous alpha-(1, 3)fucosyltransferases. J Biol Chem, 1990, 265(3): 1615–1622.

[17] Reusch D, Haberger M, Maier B, et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-part 1: separation-based methods. mAbs, 2015, 7(1): 167–179.

[18] Abès R, Teillaud JL. Impact of glycosylation on effector functions of therapeutic IgG. Pharmaceuticals, 2010, 3(1): 146–157.

[19] Jefferis R. Glycosylation of recombinant antibody therapeutics. Biotechnol Prog, 2005, 21(1): 11–16.

[20] Lammerts van Bueren JJ, Rispens T, Verploegen S, et al. Anti-galactose-α-1,3-galactose IgE from allergic patients does not bind α-galactosylated glycans on intact therapeutic antibody Fc domains. Nat Biotechnol, 2011, 29(7): 574–576.

[21] Ruhaak LR, Zauner G, Huhn C, et al. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Anal Bioanal Chem, 2010, 397(8): 3457–3481.

[22] Kamoda S, Ishikawa R, Kakehi K. Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for detailed studies on-linked oligosaccharide profile of therapeutic recombinant monoclonal antibodies. J Chromatogr A, 2006, 1133(1/2): 332–339.

[23] Fernández LEM, Kalume DE, Calvo L, et al. Characterization of a recombinant monoclonal antibody by mass spectrometry combined with liquid chromatography. J Chromatogr B, 2001, 752(2): 247–261.

[24] Sheeley DM, Merrill BM, Taylor LCE. Characterization of monoclonal antibody glycosylation: comparison of expression systems and identification of terminal α-linked galactose. Anal Biochem, 1997, 247(1): 102–110.

[25] Tangvoranuntakul P, Gagneux P, Diaz S, et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(21): 12045–12050.

[26] Qian J, Liu T, Yang L, et al. Structural characterization of N-linked oligosaccharides on monoclonal antibody cetuximab by the combination of orthogonal matrix-assisted laser desorption/ionization hybrid quadrupole-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry and sequential enzymatic digestion. Anal Biochem, 2007, 364(1): 8–18.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Characterization of N-glycosylation in an anti-EGFR monoclonal antibody produced by different expression systems

Chong Wang1, and Huaizu Guo2

1 Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection, Shanghai 201203, China 2 State Key Laboratory of Antibody Medicine and Targeted Therapy, Shanghai 201203, China

The use of mammalian expression systems results in a remarkable heterogeneity of mAb products, generally due to post-translational modifications, and glycosylation is a critical post-translation modification because it has a profound impact on the safety and efficacy of mAbs. The present study was designed to explore the impact of a different expression system on mAb N-glycosylation. The detailed structures of individual glycans between anti-EGFR monoclonal antibodies produced by different expression systems were successfully characterized at the level of free oligosaccharides using liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-fight mass spectrometry (LC-ESI-QTof MS). An alternating low and elevated collision energy scan, in source collision-induced dissociation and MS/MS in combination with exoglycosidase digestion method was also adopted. The combined data revealed that the Fab region of anti-EGFR antibody produced by CHO cell expression system had a pattern of glycosylation differing from that of the SP2/0 cell expression system whereas the Fc region remained basically unchanged. We confirmed that anti-EGFR antibody produced by SP2/0 cell expression system had a much more diverse mixture of glycans with α-Gal and an undesired, aberrant form of sialylation N-glycolylneuraminic acid (NGNA). The α-Gal was absent in mAb produced by CHO cell expression system containing sialic acid predominantly N-acetyl neuraminic acid (NANA) which is the desired, normal human-type sialylation. This study theoretically predicts that anti-EGFR antibody produced by CHO cell expression system may show better clinical tolerance, and very low potential for active hypersensitivity reactions, CHO cell lines can be the preferred expression system for producing anti-EGFR biobetter.

cell expression system, glycosylation, α-Gal, immunogenicity

10.13345/j.cjb.170074

February 26, 2017; Accepted:April 6, 2017

Chong Wang. Tel: +86-21-35325298; Fax: +86-21-50121712; E-mail: 18049823057@163.com

Supported by: R&D Public Service Platform (No. 16DZ2292900), Industry School Research Medicine (No. 16DZ1910400), Scientific Instrument Field (No. 16142201700), Enterprise International Cooperation Projects (No. 16430730400), Biological Medicine Field of Shanghai Science and Technology Support Program (Nos. 16431904100, 16431901200, 16431904700), The Shanghai “Phosphor” Youth Science and Technology Program (No. 16QB1404300).

研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái) (No. 16DZ2292900)，產(chǎn)學(xué)研醫(yī) (No. 16DZ1910400)，科學(xué)儀器領(lǐng)域 (No. 16142201700)，企業(yè)國(guó)際合作項(xiàng)目 (No. 16430730400)，上海市生物醫(yī)藥領(lǐng)域科技支撐項(xiàng)目 (Nos. 16431904100, 16431901200, 16431904700)，上海青年科技啟明星項(xiàng)目 (No. 16QB1404300) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-05-03

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170503.1658.006.html