郭園+曾星星+劉雪梅+沈遙

摘 要 為建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的樣品前處理方法以提高嬰幼兒奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取效率，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察奶粉樣品中葉黃素包埋劑的溶解特性，采用有機(jī)溶劑一步萃取的方式替代傳統(tǒng)耗時(shí)的皂化法.樣品加水破除包埋劑，后續(xù)經(jīng)乙醇溶解剩余被脂類(lèi)成分包裹的包埋劑并沉淀蛋白，再用甲基叔丁基醚在單相中一步萃取葉黃素和β-胡蘿卜素，方法無(wú)需濃縮，適用于高效液相色譜直接分析.結(jié)果表明，游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，加標(biāo)回收率為91%～94%，且所有RSD<5%.

關(guān)鍵詞 葉黃素；β-胡蘿卜素；嬰幼兒奶粉；樣品前處理；一步萃取

中圖分類(lèi)號(hào) R155 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2017）03-0053-05

One-Step Extraction of Free Lutein and β-Carotene from Infant Formula

GUO Yuan， ZENG Xing-xing， LIU Xue-mei， SHEN Yao*， CHEN Bo

（Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract We report， in this work， the establishment of a simple， rapid and accurate sample pretreatment method to improve the extraction efficiency of lutein and β-carotene in infant milk powder. To replace the time-consuming saponification method， dynamic dissolution processes of different solvents for embedding materials of lutein and simultaneous extraction of lutein and β-carotene by organic solvents were inspected using a microscope. Using water to dissolve the embedding material to free lutein and β-carotene and ethanol to precipitate proteins， we show that the sample can be extracted by methyl tert-butyl ether in monophase. After that， the extraction solution could be analyzed by HPLC without concentration. The calibration curve of free lutein and β-carotene exhibited good linearity， with both r2 equal to 0.999 9. Recoveries ranged from 91% to 94%， and relative standard deviations （RSDs） are less than 5%.

Key words lutein； β-carotene； infant formula； sample pretreatment； one-step extraction

類(lèi)胡蘿卜素具有延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗突變、預(yù)防癌癥等多種生理功能[1-2]，其中，天然葉黃素是優(yōu)良的抗氧化劑，具有預(yù)防老年性黃斑區(qū)病變、預(yù)防白內(nèi)障等獨(dú)特功能[3].β-胡蘿卜素是維生素A的重要來(lái)源，具有抗氧化以及增強(qiáng)免疫力等作用[4-5].葉黃素和β-胡蘿卜素已經(jīng)作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑廣泛用于食品加工.2012年3月頒布的《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》批準(zhǔn)了葉黃素（萬(wàn)壽菊來(lái)源）可用于嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中，其添加量分別為300～2 000 μg/kg，1 620～4 230 μg/kg[6].

葉黃素和β-胡蘿卜素均為含有多個(gè)異戊二烯單位的四萜化合物，對(duì)光、熱、氧敏感，極易發(fā)生結(jié)構(gòu)異構(gòu)化.因此，葉黃素和β-胡蘿卜素一般以其包埋體的方式添加到實(shí)際樣品中[5].葉黃素和β-胡蘿卜素的提取工藝一般為有機(jī)溶劑提取法、酶反應(yīng)提取法、超聲波輔助提取法等.有機(jī)溶劑提取法通常選用乙醚、石油醚等毒性較大的有機(jī)試劑，而且需要反復(fù)萃取多次，試劑消耗量大，萃取時(shí)間較長(zhǎng)[4].近年來(lái)，也有研究應(yīng)用皂化方法對(duì)葉黃素和β-胡蘿卜素進(jìn)行提取并同時(shí)測(cè)定，樣品需求量少，對(duì)葉黃素而言，測(cè)定結(jié)果包含酯化的葉黃素和游離態(tài)的葉黃素，準(zhǔn)確度高[7-8]，但皂化過(guò)程依舊復(fù)雜、耗時(shí)，且操作過(guò)程因操作人員的技術(shù)水平差異很容易產(chǎn)生誤差.本文從破除包埋劑、一步萃取的角度出發(fā)，采用溶劑直接溶解包埋劑，釋放葉黃素和β-胡蘿卜素，然后用溶劑一步萃取游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的方式，省去了耗時(shí)的皂化過(guò)程，且樣品無(wú)需濃縮，簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，大大縮短了樣品前處理時(shí)間，方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確.為嬰幼兒奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取測(cè)定提供新的研究視角.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：島津LC-20A高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器），UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；澳浦光電UB100i生物顯微鏡；TG 16G臺(tái)式離心機(jī)（湖南凱達(dá)公司）；WH-2微型旋渦混合儀；KQ5200B型超聲波發(fā)生器（昆山超聲儀器有限公司）；AL204電子天平（上海梅特勒-托利多公司）等.

試劑：葉黃素和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品均為西亞試劑（成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司），葉黃素包埋原料（雅培公司提供）.甲醇、甲基叔丁基醚（均為色譜純）；抗壞血酸、無(wú)水乙醇、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、石油醚、乙醚、氫氧化鉀、二氯甲烷、氯仿、乙酸丁酯、正丁醇、丙酮（均為分析純），水為去離子水.

1.2 色譜分離條件

色譜柱：大連江申P(guān)rontoSIL C30 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）；柱溫：18 ℃；進(jìn)樣體積：30 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)451 nm；流動(dòng)相：A為甲醇，B為甲基叔丁基醚；梯度洗脫程序：0～6 min， 10%～45%B； 6～10 min， 45%～90% B； 10～12 min， 90%～10%B； 12～16 min， 10%B；流速：1.0 mL/min；總運(yùn)行時(shí)間：16 min.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 分別稱(chēng)取葉黃素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品2 mg（精確到0.001 g），用無(wú)水乙醇（色譜純）溶解，分別定容至50 mL.

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度標(biāo)定 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液葉黃素500 μL，β-胡蘿卜素5 mL，用無(wú)水乙醇（色譜純）定容至10 mL作為校正液.用分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)；在各自最大吸收波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度5次，以公式C=A×10 000/E計(jì)算其實(shí)際濃度.

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜純度測(cè)定 將校正液按1.2條件進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，平行測(cè)定3次，通過(guò)面積歸一法（葉黃素7～15 min，β-胡蘿卜素12～15 min），得到標(biāo)準(zhǔn)品中全反式葉黃素和β-胡蘿卜素的色譜純度.標(biāo)定后的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度乘以其色譜純度，即得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中全反式葉黃素和β-胡蘿卜素的實(shí)際濃度.

1.4 樣品前處理方法

稱(chēng)取均勻固體樣品2 g（精確到0.001 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加5 mL水渦旋溶解.在樣品溶液中加入5 mL含0.1%BHT乙醇溶液渦旋振蕩3次，1 min/次.再向樣品溶液中加入10 mL含0.1%BHT甲基叔丁基醚溶液，渦旋3次，1 min/次.4 500 r/min下離心3 min使分層.將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶，甲基叔丁基醚定容.用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾至2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，待HPLC分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

由于葉黃素、β-胡蘿卜素易受光、熱等因素的影響，性質(zhì)不穩(wěn)定，一般采用微膠囊技術(shù)對(duì)其進(jìn)行包埋處理后再添加到實(shí)際樣品中，直接用有機(jī)溶劑提取較困難[5，8].葉黃素和β-胡蘿卜素的常用包埋劑有明膠、阿拉伯膠、酪蛋白酸鈉、麥芽糊精、蔗糖、辛烯基琥珀酸淀粉酯等[9-12]，均為水溶性包埋劑，但奶粉基質(zhì)可能存在脂類(lèi)成分包裹包埋劑的情況，此時(shí)水便無(wú)法破除被脂類(lèi)成分包裹的包埋劑.基于一步法萃取的考慮，本實(shí)驗(yàn)考察水及多種極性有機(jī)溶劑對(duì)包埋劑的溶解情況，對(duì)比去除包埋劑后多種溶劑的提取效果.

2.1.1 包埋劑溶解溶劑的選擇和優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)以葉黃素的包埋原料為代表模型，分別采用了乙酸丁酯、正丁醇、乙醇、丙酮、水共5種溶劑對(duì)原料包埋劑進(jìn)行溶解破除，在顯微鏡下觀(guān)察其溶解情況.通過(guò)顯微鏡的觀(guān)察，葉黃素包埋原料在顯微鏡下呈現(xiàn)大量包裹有黃色塊狀物質(zhì)的球形氣泡狀和少量零散的黃色塊狀顆粒（圖1a），加入不同的溶劑后，原料逐漸呈現(xiàn)出不同的情形，如圖1.直接加入正丁醇或乙酸丁酯時(shí)，顯微鏡下的氣泡狀顆粒沒(méi)有明顯變化（b）；加入乙醇或丙酮時(shí)，氣泡狀顆粒隨溶劑游動(dòng)、聚集且隨溶劑揮發(fā)逐漸破裂，其間的黃色物質(zhì)釋放出來(lái)，一段時(shí)間后，氣泡狀顆粒明顯減少，黃色塊狀顆粒物明顯增加（c，d）；加入水時(shí)，視野中瞬時(shí)間就只剩下較分散的黃色塊狀顆粒物（e）.顯微鏡的觀(guān)察結(jié)果表明，水對(duì)于包埋劑的溶解效果最佳，乙醇和丙酮次之，因此選擇水作為葉黃素和β-胡蘿卜素的包埋劑溶解劑.

2.1.2 萃取溶劑的選擇和優(yōu)化 在類(lèi)胡蘿卜素中，葉黃素屬胡蘿卜醇類(lèi)，含有羥基，極性相對(duì)較強(qiáng)，而β-胡蘿卜素屬烴類(lèi)，極性相對(duì)較弱，需要選擇極性合適的溶劑同時(shí)實(shí)現(xiàn)二者的高提取率.基于奶粉基質(zhì)中含有大量的蛋白和其他配方成分，考察了奶粉樣品在水溶液中被分散并破除包埋劑后，直接用有機(jī)溶劑渦旋萃取并離心的情況，所用有機(jī)溶劑分別為二氯甲烷、乙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、正丁醇、丙酮、氯仿、石油醚（圖2）.結(jié)果表明，奶粉加水后，直接加二氯甲烷/乙醚/甲基叔丁基醚/正丁醇/氯仿/石油醚形成乳狀懸濁液，且離心后無(wú)明顯變化（見(jiàn)圖2 a，b，c，e，g，h），說(shuō)明這些溶劑無(wú)法實(shí)現(xiàn)直接萃??；直接加乙醇或丙酮可使蛋白變性，離心后，蛋白層和溶劑層分層明顯（見(jiàn)圖2 d，f），但由圖3 a，b可知，溶劑層中的葉黃素和β-胡蘿卜素并未完全溶解.在此溶劑層的基礎(chǔ)上，再選擇的合適溶劑便可溶解該相中的葉黃素和β-胡蘿卜素.

雖然乙醇和丙酮均可沉淀蛋白，但由于乙醇極性較大、毒性較低，且乙醇也能溶解部分被脂質(zhì)所包裹的葉黃素包埋劑，使葉黃素完全釋放出來(lái)，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用乙醇以沉淀蛋白.

以葉黃素包埋原料為例，進(jìn)一步考察原料依次加入水和乙醇釋放出葉黃素后，常用類(lèi)胡蘿卜素提取溶劑乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚對(duì)其的溶解提取效果.圖3a表明依次加入水和乙醇后葉黃素以塊狀存在，并未完全溶解，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入萃取劑二氯甲烷（圖3c）或者甲基叔丁基醚（圖3d）后對(duì)比加入乙醇后（圖3a）的顯微鏡結(jié)果表明，黃色塊狀顆粒逐漸溶解，溶液顏色明顯變黃，說(shuō)明合適的萃取溶劑可以將葉黃素有效地溶解提取出來(lái).β-胡蘿卜素的極性較葉黃素更弱，乙醇對(duì)其溶解和萃取效率將會(huì)更低，二氯甲烷毒性較大，不能直接進(jìn)液相色譜儀分析，甲基叔丁基醚萃取液的液相色譜分析結(jié)果表明其對(duì)葉黃素和β-胡蘿卜素的提取效果均較好；另外，加入甲基叔丁基醚離心后，有機(jī)相與水相分層，蛋白浮于兩相分層處，便于操作，因此本文實(shí)驗(yàn)最終選擇甲基叔丁基醚作為萃取溶劑.奶粉樣品中葉黃素和β-胡蘿卜素同時(shí)提取并分析的色譜圖見(jiàn)圖4.

2.2 色譜分離條件優(yōu)化

若要在盡量短的時(shí)間內(nèi)對(duì)二者同時(shí)分析，則必須采用梯度洗脫.對(duì)葉黃素進(jìn)行定量計(jì)算時(shí)，通常把13-順式和13′-順式的兩個(gè)順式葉黃素也共同納入計(jì)算[13]，因此梯度條件還須保證三個(gè)順?lè)词饺~黃素的分離.實(shí)驗(yàn)以10%甲基叔丁基醚為起始比例，后逐步增加甲基叔丁基醚至45%先洗脫出葉黃素，再增加甲基叔丁基醚到90%洗脫出β-胡蘿卜素，較好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)葉黃素三個(gè)順?lè)串悩?gòu)體及β-胡蘿卜素的分離（見(jiàn)圖4）.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

分別準(zhǔn)確吸取1.3中已標(biāo)定的葉黃素和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯蟮臐舛确謩e為0.038 44，0.048 05，0.096 11，0.192 2，0.480 5，0.961 1 mg/L和0.027 79，0.055 59，0.139 0，0.277 9，0.555 9，1.390 mg/L，按1.2條件進(jìn)行測(cè)定.標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性見(jiàn)表1.

2.4 加標(biāo)回收率

在已知含量的奶粉樣品中分別進(jìn)行葉黃素和β-胡蘿卜素的高、中、低3個(gè)濃度水平的加標(biāo)，每組做3個(gè)平行，每個(gè)平行連續(xù)分析3次，平均加標(biāo)回收率范圍分別為91.80%～93.46%和91.94%～94.22%，全部RSD<5%（見(jiàn)表2）.與文獻(xiàn)方法[7]中的加標(biāo)回收率80%～90%相比，本方法回收率良好.

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

對(duì)比本方法與文獻(xiàn)方法[7]中的皂化方法對(duì)市售奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做6組平行樣，每組平行樣連續(xù)分析3次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，本方法RSD<6%，精密度良好.方法還對(duì)不同廠(chǎng)家的不同配方奶粉進(jìn)行了廣泛的驗(yàn)證，結(jié)果表明本文提出的方法對(duì)于基礎(chǔ)配方奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素的測(cè)定有明顯的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于某些特殊工藝的配方奶粉（如樣品3）中葉黃素和β-胡蘿卜素的測(cè)定結(jié)果則稍稍偏低，這可能是由于在特殊配方的復(fù)雜工藝中少量添加的葉黃素和β-胡蘿卜素以酯化形式存在而造成的.

3 結(jié)論

本文對(duì)嬰幼兒配方奶粉的前處理方法進(jìn)行研究，省去了耗時(shí)的皂化方法，從破除包埋劑、一步萃取的角度出發(fā)，用水溶解包埋劑，釋放出葉黃素和β-胡蘿卜素，乙醇沉淀蛋白，再采取甲基叔丁基醚直接提取的方式，建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定樣品中游離態(tài)葉黃素和β-胡蘿卜素的方法.本方法與文獻(xiàn)中的皂化方法對(duì)市售奶粉的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表明，該方法盡管在某些生產(chǎn)商的特殊配方奶粉測(cè)定中稍顯不足，但是對(duì)市場(chǎng)占有率最大的各生產(chǎn)商基礎(chǔ)配方奶粉中葉黃素和β-胡蘿卜素分析時(shí)則有明顯的優(yōu)勢(shì)：步驟簡(jiǎn)單，速度快，結(jié)果準(zhǔn)確度高，精密度好.

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