孫冰潔

(第二軍醫(yī)大學學員旅，上海 200433)

人參多糖對耐順鉑人鼻咽癌細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機制

孫冰潔

(第二軍醫(yī)大學學員旅，上海 200433)

目的 探討人參多糖(GPS)對耐順鉑人鼻咽癌細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機制。方法 選擇藥物敏感鼻咽癌細胞CNE-2作為親本細胞，并建立耐順鉑的鼻咽癌耐藥細胞株系CNE-2(簡稱耐藥CNE-2)。采用MTT法檢測親本細胞及耐藥CNE-2經(jīng)GPS作用前后對順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并計算耐藥指數(shù)(RI)；流式細胞儀檢測GPS對耐藥CNE-2的增殖抑制率；RT-PCR法檢測GPS作用前后耐藥CNE-2中β-catenin mRNA表達；顯微鏡觀察GPS作用前后耐藥CNE-2中β-catenin蛋白表達。結(jié)果 親本細胞及耐藥CNE-2對順鉑的IC50分別為(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐藥CNE-2對順鉑的RI為26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐藥CNE-2對順鉑的IC50分別為(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分別為9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐藥CNE-2對順鉑IC50、RI均較作用前明顯降低(P均<0.05)。GPS對耐藥CNE-2的增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性(P均<0.05)。0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h，耐藥CNE-2中β-catenin mRNA相對表達量分別為0.973±0.114、0.809±0.038、0.706±0.050、0.297±0.010，與耐藥CNE-2比較，0.3 g/L及0.4 g/L GPS作用后β-catenin mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)。GPS作用前β-catenin蛋白的表達區(qū)域在細胞核以及細胞質(zhì)，經(jīng)GPS處理后，β-catenin蛋白表達區(qū)域逐漸向細胞膜轉(zhuǎn)移。結(jié)論 GPS可逆轉(zhuǎn)CNE-2對順鉑的耐藥性；其機制可能為通過β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑誘導耐藥株系凋亡。

鼻咽癌；人參多糖；耐順鉑；多藥耐藥；耐藥逆轉(zhuǎn)

鼻咽癌對放射治療和化學治療較為敏感，但近年來出現(xiàn)了耐藥細胞株，患者5年存活率僅60%左右[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人參的主要藥用價值成分人參多糖(GPS)在人體內(nèi)外均具有較為明顯的抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用[2]，但其機制仍不清楚。2016年2～10月，本研究觀察了GPS對耐順鉑人鼻咽癌細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制，以期解決鼻咽癌的多藥耐藥問題。

1 材料與方法

1.1 材料 GPS注射液為普德藥業(yè)公司(山西)生產(chǎn)(規(guī)格3 g/L)，順鉑為澳大利亞某公司生產(chǎn)；人鼻咽癌低分化細胞株系CNE-2為香港大學腫瘤系所提供，二甲基四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司生產(chǎn)，CCK8試劑由日本同仁研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐藥細胞株誘導 將CNE-2細胞置于37 ℃、5% CO2及適宜濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3]。采用MTT法測定順鉑對CNE-2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50，0.21 μmol/L)；用含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞1天，換含有半數(shù)抑制濃度的培養(yǎng)基來培養(yǎng)8天，直至細胞能夠穩(wěn)定生長，繼續(xù)傳代3次[4]，測定此時的IC50。再用含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基沖擊培養(yǎng)1天，更換為順鉑IC50逐漸提高的培養(yǎng)基，直至細胞能夠在含順鉑3.3 μmol/L的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并且連續(xù)傳代3次[5]，最后測定順鉑的IC50為7.5 μmol/L，同時將其命名為耐順鉑的鼻咽癌耐藥細胞株系CNE-2(簡稱耐藥CNE-2)。

1.2.2 GPS干預及藥物敏感性測定 采用MTT法。取對數(shù)生長期的親本細胞及耐藥CNE-2，調(diào)整細胞密度1×105個/mL，加入96孔板，設親本細胞、耐藥CNE-2及GPS(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)處理孔，每孔體積200 μL，做3個平行孔板[6]。培養(yǎng)48 h，于每個孔加入15 μL MTT(10 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，于每孔中加入200 μL DMSO，稍震蕩溶解結(jié)晶。以490 nm作為檢測波長，并在酶標儀上檢測各孔的吸光度數(shù)值[7]，利用MTT分析軟件來進行數(shù)據(jù)分析，計算IC50以及耐藥指數(shù)(RI)，得出藥物敏感性。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.3 GPS對耐藥CNE-2增殖影響的觀察 采用CCK8法。取對數(shù)生長期耐藥CNE-2，制成密度為5×104個/L的細胞懸液，將100 μL的細胞懸液接種在96孔板上，1天后加入100 μL不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)的GPS培養(yǎng)液，并設空白對照，于作用24、48、72 h時進行CCK8比色試驗[8]。每次均在處理結(jié)束前4 h，在每個孔中加入10 μL的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-AGPS/A空白對照)×100%[9]，結(jié)果重復3次。

1.2.4 GPS對耐藥CNE-2 β-catenin mRNA表達影響的觀察 采用RT-PCR法。取對數(shù)生長期，并經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h的耐藥CNE-2，TRIzol法提取RNA，檢測β-catenin mRNA表達。PCR反應步驟：反應體系10 μL(2.5 μL模板，上下引物均勻后取2.5 μL，5 μL的SYBR熒光酶)，循環(huán)環(huán)境條件：95 ℃預變性10 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。最終數(shù)據(jù)利用ABI Prism 7000 SDS軟件進行相關數(shù)據(jù)分析，ΔCt=源基因Ct-內(nèi)參照Ct，mRNA的表達=2-ΔCt[10]。

1.2.5 GPS對耐藥CNE-2 β-catenin蛋白表達區(qū)域影響的觀察 采用顯微鏡觀察耐藥CNE-2中β-catenin蛋白表達區(qū)域。取對數(shù)生長期耐藥CNE-2，接種于6孔板中，37 ℃下于CO2培養(yǎng)箱過夜，待細胞株均貼壁后，加入0.4 g/L GPS處理48 h，空白對照加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。4%多聚甲醛室溫條件下固定20 min，PBS沖洗3次(每次10 min)，5%的BSA封閉透膜1 h，PBS沖洗3次(每次5 min)[11]。β-catenin單克隆抗體溶液的稀釋濃度為1∶400，顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GPS作用前后耐藥CNE-2對順鉑IC50及RI比較 親本細胞及耐藥CNE-2對順鉑的IC50分別為(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐藥CNE-2對順鉑的RI為26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐藥CNE-2對順鉑的IC50分別為(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分別為9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐藥CNE-2對順鉑IC50、RI均較作用前明顯降低(P均<0.05)。

2.2 GPS對耐藥CNE-2增殖的影響 GPS對耐藥CNE-2的增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性(P均<0.05)。見表1。

表1 不同濃度和時間點GPS對耐藥CNE-2的增殖抑制率

注：與0.1 g/L比較，#P<0.05；與相同濃度作用24 h比較，*P<0.05。

2.3 耐藥CNE-2 β-catenin mRNA表達 0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS處理48 h后耐藥CNE-2中β-catenin mRNA相對表達量分別為(0.973±0.114)、(0.809±0.038)、(0.706±0.050)、(0.297±0.010)，組間比較P<0.05。

2.4 耐藥CNE-2 β-catenin蛋白表達區(qū)域 GPS作用前β-catenin蛋白的表達區(qū)域在細胞核以及細胞質(zhì)，經(jīng)GPS處理后，β-catenin蛋白表達區(qū)域逐漸向細胞膜轉(zhuǎn)移。

3 討論

腫瘤細胞耐藥性的發(fā)生是藥物作用誘導的結(jié)果還是“不適者淘汰”的選擇機制所致，目前尚無定論，更多學者傾向于雙向作用機制，因為耐藥誘導階段，不論是大劑量沖擊還是小劑量逐漸增加，在特定的時間段都會引起培養(yǎng)細胞的死亡，存活細胞也會在形態(tài)上有顯著改變，并失去增殖活性[12]。同時在耐藥起初階段，反復出現(xiàn)的過程需要更多的新鮮親代細胞源源不斷的補充，補充的新鮮親代細胞和已經(jīng)具備一定耐藥性但無增殖能力的細胞之間會建立一種“信息交流”途徑，使得具有增殖能力且耐藥性細胞最終被選擇出來，誘導分化，最終耐藥菌株大量出現(xiàn)。

GPS可明顯增加人體的免疫系統(tǒng)功能，還有抗腫瘤以及輔助治療腫瘤性疾病的功能，可提高因放療而被抑制的免疫系統(tǒng)功能[13]，可在一定程度上減輕放療不良反應。GPS能調(diào)節(jié)免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性、抑制腫瘤致病因子的作用和抗基因突變。Wnt/β-catenin信號傳導通路發(fā)生異常改變時與腫瘤的發(fā)生密切相關，而β-catenin是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號傳導通路中非常重要的信號傳遞分子。謝方云等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin經(jīng)典信號傳導通路的異常激活以β-catenin分子改變?yōu)楹诵?，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌有Wnt/β-catenin經(jīng)典信號傳導通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，GPS作用后，耐藥CNE-2的IC50及RI均明顯降低，耐藥CNE-2增殖明顯抑制，且呈劑量和時間依賴性；耐藥CNE-2β-catenin mRNA相對表達明顯降低，β-catenin蛋白的表達區(qū)域向胞膜轉(zhuǎn)移，可見GPS下調(diào)了β-catenin的轉(zhuǎn)錄功能以及蛋白的翻譯表達過程，可能原因在于TCF4作為一種研究較為透徹的Wnt/β-catenin信號傳導通路常見的下游信號分子，當Wnt分子信號被激活后，TCF4所對應的氨基端會與Wnt信號傳導通路的上游信號傳導分子β-catenin Arn重復序列結(jié)合形成復合體，并將其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，但氨基端的HMG分子會與啟動子中的靶基因調(diào)控序列相結(jié)合，繼而可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄的激活作用，本研究中發(fā)現(xiàn)了TCF4信號分子的表達轉(zhuǎn)移，所以推測GPS對于CNE-2的影響可能是通過TCF4影響β-catenin分子的胞核轉(zhuǎn)移以及靶基因的活性結(jié)合產(chǎn)生。

綜上所述，GPS對耐順鉑人鼻咽癌耐藥細胞具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其機制可能是通過β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑誘導耐藥株系CNE-2的凋亡。本研究結(jié)果對指導鼻咽癌的進一步治療以及改善患者預后具有一定意義。

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