劉麗秋，王 莉，崔國利，周奎臣，辛 華，江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

環(huán)六縮酚肽抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性及作用機制①

劉麗秋，王 莉，崔國利，周奎臣，辛 華，江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：分析環(huán)六縮酚肽對人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的增殖活性作用，并對其作用機制進行研究。方法：設(shè)置空白對照組(加入0.1% 二甲基亞砜)、陽性對照組(加入奧沙利鉑)和環(huán)六縮酚肽組(加入環(huán)六縮酚肽)3組，利用噻唑藍(lán)(MTT)法測定各組人PC-3細(xì)胞的增殖率，利用TUNEL法測定各組人PC-3細(xì)胞的凋亡率，利用Westernblot法測定各組人PC-3細(xì)胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的調(diào)控情況。結(jié)果：培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞增殖率為(35.8±2.78)%、(44.8±3.00)%和(32.3±1.96)%、(38.1±2.12)%，人PC-3細(xì)胞凋亡率為(45.2±3.60)%、(48.2±3.71)%和(48.3±3.07)%、(50.1±4.15)%，與空白對照組的(100.0±2.16)%、(100.0±2.61)%和(6.0±0.95)%、(6.3±1.05)%對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：環(huán)六縮酚肽具有抑制人PC-3細(xì)胞增殖及凋亡的作用，通過caspase-3和Bax可對PC-3細(xì)胞的凋亡進行誘導(dǎo)。

前列腺癌細(xì)胞；環(huán)六縮酚肽；細(xì)胞凋亡；抑制活性

生物體內(nèi)活性肽為分子聚合物，介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間，在生理學(xué)上具有重要的研究價值和意義[1]。環(huán)肽的穩(wěn)定性較線性多肽強，其具有多種醫(yī)藥價值和生理功能，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[2]。本研究在土壤真菌中對三種環(huán)六縮酚肽化合物進行分離，并對環(huán)六縮酚肽抑制人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)增殖活性及作用機制進行了研究，旨在為環(huán)肽類化合物的進一步運用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

本研究所選用的PullularinC、PseudodestruxinC和DestruxinB三種環(huán)六縮酚肽化合物均由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室提供；RPMI1640 培養(yǎng)基由上海博升生物科技有限公司提供；噻唑藍(lán)(MTT)由上海士鋒生物科技有限公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒(顯色法)由美國MerckMillipore公司提供；Bax和β-actin抗體均由SantaCruzBiotechnology公司提供；Caspase抑制劑/凋亡抑制劑Z-VAD-FMK由上海前塵生物科技有限公司提供。人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)由中國科學(xué)院提供，在直徑100mm的培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，于5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。

1.2 方法

(1)MTT法[3]

人PC-3細(xì)胞懸浮接種于96孔板上，50μL/孔，設(shè)置空白對照組、陽性對照組、環(huán)六縮酚肽組3組，即加入0.1% 二甲基亞砜(DMSO)溶劑，加入奧沙利鉑，加入環(huán)六縮酚肽；各組設(shè)3復(fù)孔，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，各孔添加5g·L-1MTT10μL，采用酶聯(lián)免疫檢測儀對吸光度值(OD值)進行測定，得出細(xì)胞增殖抑制率。

(2)TUNEL法[4]

人PC-3細(xì)胞懸浮接種于8孔玻片中，400μL/孔，20h后添加PullularinC(終濃度1μmol·L-1)。12h后，使用5%多聚甲醛(PFA)固定，pbs緩沖液浸洗；TritonX-100通透液通透后，根據(jù)操作說明書進行TUNEL法檢測。隨機選取5個高倍視野，記數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞所占百分比的平均值作為細(xì)胞凋亡率。

(3)Westernblot法[5]

以2×106個細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種PC-3細(xì)胞，添加陽性對照順鉑(終濃度2μmol·L-1)和PullularinC培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，提取蛋白50μg，于SDS-PAGE電泳下分離、轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗后，洗膜并添加ECL試劑，利用膠片曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件TheSASsystem6.12處理數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量資料，進行t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人PC-3細(xì)胞的增殖

培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞增殖率降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組前列腺癌細(xì)胞增殖率的對比±s，%)

2.2 人PC-3細(xì)胞的凋亡

培養(yǎng)24h和48h后，陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組人PC-3細(xì)胞凋亡率增加，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組前列腺癌細(xì)胞凋亡率的對比±s，%)

2.3 人PC-3細(xì)胞Caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的調(diào)控

陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

3 討論

前列腺癌是男性患者常見的惡性腫瘤，常規(guī)抗癌藥物易產(chǎn)生耐藥性，故尋求高效低毒的治療藥物成為臨床研究的重點，其中在自然界中尋找新的抗癌活性成分也成為臨床研究的熱點問題之一[6,7]。本研究對人前列腺癌進行體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)六縮酚酞可對人前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生一定作用，其作用明顯優(yōu)于奧沙利鉑[8]。近幾年來，多肽類物質(zhì)治療癌癥的研究越來越多，已有研究證實多肽類物質(zhì)治療癌癥的臨床療效十分明顯，其具有不良反應(yīng)少、抗癌活性強、不易產(chǎn)生耐藥性等特點[9]。環(huán)六縮酚肽屬于小分子多肽類物質(zhì)，其表現(xiàn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與線性多肽相比，環(huán)六縮酚酞的性質(zhì)更加穩(wěn)定。在前列腺癌組培養(yǎng)液中添加環(huán)六縮酚肽，培養(yǎng)24h和48h后，環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞增殖率降低、凋亡率升高，且第三代鉑類抗癌藥奧沙利鉑與環(huán)六縮酚肽抑制前列腺癌細(xì)胞生長、促進前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用相當(dāng)，其中環(huán)六縮酚肽的作用更加明顯。現(xiàn)有的研究結(jié)果證實：線粒體/細(xì)胞色素C/Caspase-9/Caspase-3是人體細(xì)胞凋亡的主要途徑[10]，機體在接收外界信號后，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)的外界信號激活Caspase-3，激活Caspase-3使細(xì)胞核內(nèi)DNA剪切，從而產(chǎn)生促使細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞在凋亡過程中，機體會通過對Caspase-3活性的調(diào)節(jié)對細(xì)胞的凋亡進行調(diào)控，同時通過對線粒體功能進行調(diào)控也可對細(xì)胞的凋亡進行調(diào)控。線粒體功能的調(diào)控過程中，調(diào)控蛋白bcl-2和Bax的作用十分重要，然而bcl-2和Bax的作用又是完全不同的。bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，bcl-2和Bax結(jié)合可導(dǎo)致bcl-2抗細(xì)胞凋亡作用消失，而Bax則可促使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：陽性對照組和環(huán)六縮酚肽組前列腺癌細(xì)胞中bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，與空白對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。表明環(huán)六縮酚肽通過激活Caspase-3促進前列腺癌細(xì)胞凋亡，與此同時通過促進Bax表達(dá)、抑制bcl-2表達(dá)對線粒體功能進行調(diào)控，從而起到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖活性的作用。綜上所述，環(huán)六縮酚肽具有抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性的作用，通過本研究所證實的上述途徑可促使細(xì)胞凋亡，即通過caspase- 3、Bax、bcl-2介導(dǎo)誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡；但腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生是多途徑共同作用的結(jié)果，所以環(huán)六縮酚肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機制還需進一步研究。

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1.黑龍江省自然科學(xué)基金項目，編號：D201225；2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點項目，編號：12Z1201504。

劉麗秋(1978～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主管技師。

江清林(1964～)男，黑龍江林口人，碩士，研究員，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:jqljms@126.com。

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