姜文強(qiáng)，陳玉強(qiáng)，王彤旭，呂 鑫，王亞洲

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

PCDH10基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)①

姜文強(qiáng)，陳玉強(qiáng)，王彤旭，呂 鑫，王亞洲

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中PCDH10基因表達(dá)mRNA水平及其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)，探究該基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：選取2016-01～2017-02于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科直接行手術(shù)切除治療的60例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，采用甲基化PCR (MSP)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)兩者組織中PCDH 10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和mRNA水平情況，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果：PCDH10基因在結(jié)直腸癌組織中見(jiàn)啟動(dòng)子明顯異常甲基化，比例為53.3%(32/60)，遠(yuǎn)高于癌旁組織8.3%(5/60)，二者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在結(jié)直腸癌組織中其mRNA表達(dá)只有8.3%(5/60)，大多數(shù)表達(dá)沉默，而在癌旁組織中高表達(dá)90%(54/60)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCDH10基因異常甲基化與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小未見(jiàn)相關(guān)(P>0.05)，與Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：PCDH10基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)大多數(shù)沉默，但其啟動(dòng)子異常甲基化顯著，說(shuō)明該基因可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有抑制作用。

結(jié)直腸癌；PCDH10；甲基化；mRNA表達(dá)

在我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率為9.2-17.0/10萬(wàn)，并且有逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病人群也有年輕化趨勢(shì)，因此結(jié)直腸癌一直在我國(guó)消化道腫瘤研究領(lǐng)域中，是重點(diǎn)研究的惡性腫瘤之一[1]。PCDH10基因是新近發(fā)現(xiàn)的原鈣黏蛋白基因，其編碼蛋白參與細(xì)胞分化、細(xì)胞間黏附及信息傳遞等重要功能[2，3]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，PCDH10基因啟動(dòng)子異常甲基化和表達(dá)異常，發(fā)生在宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌等多種惡性腫瘤中，說(shuō)明該基因?qū)σ种颇[瘤生長(zhǎng)、遷移、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[4]。本研究檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中PCDH10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和mRNA水平情況，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行分析，探討PCDH10基因在結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展中的作用，為最終可能成為新的治療手段和抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

取自2016-01～2017-02于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，直接行手術(shù)切除治療而未行任何輔助治療的患者60例。其中男36例，女24例；年齡38～80歲，中位年齡60.5歲；結(jié)腸癌39例，直腸癌21例；腫瘤直徑>4cm28例，≤4cm32例；高中分化37例，低分化23例；Dukes分期A+B期45例，C+D期15例；有淋巴轉(zhuǎn)移16例，未見(jiàn)淋巴轉(zhuǎn)移44例。從手術(shù)室獲取組織標(biāo)本后，保存在液氮罐中，登記編號(hào)后置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存，用于提取相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料。手術(shù)切除的腫物經(jīng)病理科診斷證實(shí)為結(jié)直腸癌組織(腺癌)；對(duì)照組為手術(shù)切除配對(duì)的癌旁組織(距腫瘤切緣5cm以上)，并在病理科診斷證實(shí)為良性組織。本實(shí)驗(yàn)中所有患者均已知情同意，并且經(jīng)過(guò)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染色體DNA提?。喊凑誅NA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))及DNA甲基化試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))說(shuō)明書(shū)操作步驟分別進(jìn)行DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾，每次進(jìn)行修飾的DNA量為1μg，經(jīng)過(guò)修飾的DNA立即進(jìn)行MSP檢測(cè)，或置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MSP檢測(cè)PCDH10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)：引物參照文獻(xiàn)[4]中的序列，由上海生工生物工程有限公司合成,甲基化上游引物序列為5'-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3'；下游引物序列為5'-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3'；非甲基化上游引物序列為5’-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3'；下游引物序列為5'-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3’。MSP反應(yīng)體系為25μL， 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，甲基化引物退火60℃(非甲基化引物退火58℃) 30s,72℃延伸30s，一共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。無(wú)菌去離子水作為空自對(duì)照。

1.2.3 從組織標(biāo)本中提取總RNA：按照Trizol試劑(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)提取組織標(biāo)本RNA，采用Fermentas(美國(guó))的DNA提取試劑盒合成cDNA，轉(zhuǎn)錄所得的cDNA儲(chǔ)存于-20℃作為模板用于半定量RT-PCR。

1.2.4 采用RT-PCR：PCR反應(yīng)體系為25μL，按照試劑盒(QIAGEN，德國(guó))的要求所有操作都在冰上進(jìn)行以基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:1)反應(yīng)體系：模板基因組DNA1μL,Hotstart聚合酶0.125μL、10UmPCDH10上下游引物各0.75μL、10UmGAPDH上下游引物各0.5μL、dNTP(10Mm) 0.5μL、10xreactionbuffer2.5μL、Q-SOLUTION5μL、ddH20 13.5μL。2)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s，10個(gè)循環(huán)；95℃ 30s，52℃ 30s， 72℃ 40s， 24個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。最后1.5%的瓊脂糖檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，凝膠成像分析儀成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件，采用卡方檢驗(yàn)方法進(jìn)行，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PCDH10甲基化情況

在結(jié)直腸癌組織中，PCDH10基因明顯異常甲基化，比例為53.3%(32/60)，遠(yuǎn)高于癌旁組織8.3%(5/60)，二者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2PCDH10基因mRNA水平表達(dá)

PCDH10癌旁組織中高表達(dá)90%(54/60)；在絕大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中mRNA表達(dá)沉默，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的PCDH10基因甲基化水平

表2 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的PCDH10基因mRNA水平

2.3 甲基化情況水平與患者臨床病理特征

PCDH10基因異常甲基化與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤大小未見(jiàn)相關(guān)(P>0.05)，但與Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 PCDH10在原發(fā)結(jié)直腸癌組織中的甲基化情況水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

隨著對(duì)腫瘤的成因及致病機(jī)制不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)異常是腫瘤形成的重要機(jī)制，其中較深入研究是DNA甲基化[5]。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制表達(dá)[6～8]。PCDH10基因(又稱(chēng)為OL-protocadherin和KIAA1400)，位于染色體4q28.3，長(zhǎng)約42.26kb。早期對(duì)PCDH10研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)方面，認(rèn)為其異常表達(dá)可以影響神經(jīng)元活性，是自閉癥相關(guān)基因；近來(lái)有研究表明其異常表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、浸潤(rùn)和集落形成[9]。本研究中，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中，PCDH10基因明顯異常甲基化高于癌旁正常組織；而癌旁正常組織中PCDH10高表達(dá)遠(yuǎn)高于結(jié)直腸癌組織，表明該基因異常甲基化及表達(dá)沉默可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生；PCDH10基因異常甲基化與患者臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示該基因甲基化在結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展中有影響。綜上所述，PCDH10基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，這對(duì)進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、臨床治療有著重要意義，最終可能成為新的治療手段和抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016_043。

姜文強(qiáng)(1990～)男，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生，醫(yī)師。

陳玉強(qiáng)(1969～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E- mail: 522712134@qq.com。

R735.3+5；R735.3+

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1008-0104(2017)03-0104-02

2016-12-04)