王晴，周巖，韓會，汪鳳蘭，邢鳳梅

(華北理工大學(xué)護理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山 063000)

NECA對大鼠離體缺血再灌注心肌細胞自噬的調(diào)控作用

王晴，周巖，韓會，汪鳳蘭，邢鳳梅

(華北理工大學(xué)護理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山 063000)

目的 觀察非選擇性腺苷受體激動劑5′-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)對離體心肌缺血再灌注大鼠細胞自噬的調(diào)控作用。方法 將42只Wistar大鼠隨機分為Sham組、I/R組、NECA組，各14只。Sham組心臟只穿線但不結(jié)扎缺血，用Kerbs-Henseleit緩沖液持續(xù)灌流170 min。I/R組、NECA組使用Langendorff裝置制備大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型，且NECA組再灌注前分別給予含NECA的灌流液。透射電鏡觀察各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變；Western blotting法檢測自噬標志蛋白Beclin-1、LC3的表達。結(jié)果 Sham組、NECA組透射電鏡下未見自噬體存在，但在I/R組可見多處典型的自噬現(xiàn)象。與Sham組相比，I/R組Beclin-1蛋白表達高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高(P均<0.05)。與I/R組相比，NECA組Beclin-1蛋白表達低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低(P均<0.05)。結(jié)論 NECA可通過降低大鼠心肌細胞自噬發(fā)揮心肌保護作用。

5′-N-乙基酰胺基腺苷；心肌缺血再灌注損傷；自噬

心肌缺血再灌注損傷涉及多種細胞分子機制，包括炎癥反應(yīng)、鈣超載、線粒體損傷、細胞凋亡以及自噬等[1]。自噬是一種細胞保護機制，正常情況下細胞的自噬水平較低。但在心肌缺血、再灌注過程中，心肌細胞自噬水平顯著上調(diào)，過度自噬導(dǎo)致心肌細胞死亡，抑制過度的自噬活動可有效減輕心肌細胞的損傷[2]，因此自噬成為研究心肌缺血再灌注損傷機制的重要靶點。NECA是一種非選擇性腺苷受體激動劑，能夠通過縮小梗死面積、減輕炎癥反應(yīng)、改善左心室功能來保護受損的心肌[3]。已有研究[4]證實，NECA可有效減少心肌缺血再灌注損傷，但保護作用機制尚不清楚。Beclin-1、LC3是心肌細胞自噬標志蛋白。2015年8月～2016年3月,本研究觀察了NECA對大鼠離體缺血再灌注心肌細胞Beclin-1、LC3表達及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，探討NECA對大鼠離體缺血再灌注心肌細胞自噬的調(diào)控作用，為臨床急性心肌梗死的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器 SPF級健康成年雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量250～300 g，由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供。生長環(huán)境：恒溫(18～24 ℃)、恒濕(45%～50%)、明暗交替各12 h，嚴格遵守國家頒布的實驗動物管理條例和實驗動物管理實施細則。NECA購自英國TOCRIS公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Beyotime生物技術(shù)研究所，兔源Beclin-1單克隆抗體、兔源LC3B單克隆抗體、兔源β-tubulin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，辣根過氧化物酶標記抗兔IgG(H+L)購自美國KPL公司。Langendorff灌流設(shè)備、多道生理信號采集設(shè)備購自四川成都儀器廠，H-7650透射電子顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型制備方法 采用Langendorff心臟灌注模型法構(gòu)建大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，仰臥位固定，開胸后迅速取出心臟懸掛在Langendorff灌流設(shè)備上進行主動脈逆流。將連有壓力傳感器的乳膠球囊放入左心室中，通過調(diào)節(jié)球囊內(nèi)溶液容量使左室舒張末壓保持在5～10 mmHg。待心臟穩(wěn)定20 min后結(jié)扎左冠狀動脈前降支，造成心臟局部缺血。30 min后松開，使缺血部位再灌注。

1.3 實驗分組及處理 將42只Wistar大鼠隨機分為Sham組、I/R組、NECA組各14只。Sham組心臟只穿線但不結(jié)扎，用Kerbs-Henseleit緩沖液持續(xù)灌流170 min。其他2組制備大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型。I/R組再灌注2 h。NECA組再灌注2 h，于再灌注前5 min給予含0.1 μmol/L NECA的灌流液，至再灌注30 min時結(jié)束。

1.4 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察 取適量心肌組織，放于4 ℃的2.5%戊二醛溶液前固定，用磷酸鹽緩沖液清洗后再用1%鋨酸固定液進行后固定。再次清洗后脫水，用100%丙酮與包埋液浸透包埋，聚合烤片，切片，滴加醋酸鈾染液和枸櫞酸鉛染色液進行雙染色，通過透射電鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及有無自噬現(xiàn)象發(fā)生。細胞發(fā)生自噬的金標準：在電鏡下可觀察到心肌細胞在雙層膜或單層膜結(jié)構(gòu)內(nèi)出現(xiàn)包含細胞器的自噬泡[5]。

1.5 各組大鼠心肌細胞Beclin-1、LC3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取適量心肌組織，提取蛋白，利用酶標儀計算待測蛋白濃度，進而確定蛋白上樣量，將蛋白分裝、變性。制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)的PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉。分別滴加兔源Beclin-1、LC3B一抗，4 ℃水平搖床過夜，用TBST洗膜，加入相對應(yīng)的酶標二抗，37 ℃孵育1～2 h。再次洗膜后進行顯色，以β-tubulin為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算Beclin-1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較 Sham組肌絲排列致密規(guī)則，肌節(jié)形態(tài)完整，嵴排列整齊。I/R組大部分肌絲斷裂、缺失，肌節(jié)攣縮，嵴排列稀疏甚至斷裂。NECA組的損傷較I/R組減輕，肌絲排列較規(guī)則，肌節(jié)輕度攣縮。Sham組、NECA組沒有自噬體存在，但I/R組存在多處典型的自噬現(xiàn)象，可見正在吞噬或者正在消化溶解的包裹著線粒體及其他細胞器的單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。

2.2 各組大鼠心肌細胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較 見表1。

表1 各組大鼠心肌細胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05。

3 討論

自噬是一種高度保守的細胞降解過程，可通過溶酶體降解內(nèi)容物來實現(xiàn)細胞本身代謝平衡[1]。自噬對細胞的影響是雙向的，適度的自噬可以幫助細胞對受損蛋白質(zhì)與細胞器進行分解和再利用，但自噬程序過度激活會導(dǎo)致細胞死亡[6]。目前自噬在心肌缺血再灌注損傷中的研究結(jié)果不一致，通常認為，自噬在心肌缺血階段起保護作用，但在再灌注階段會加重心肌損傷[2]。有研究[7]表明，心肌缺血再灌注損傷時心肌細胞呈現(xiàn)出強烈的自噬特性，且在再灌注期間，自噬水平與心肌損傷程度呈正相關(guān)。因此，自噬可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的切入點。

目前，NECA已成為治療心肌梗死最有前景的藥物之一，但由于其保護作用機制尚不明確，在臨床上應(yīng)用受限[6]。我們的前期實驗表明，NECA可有效減少心肌缺血再灌注所導(dǎo)致的細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而關(guān)于NECA對心肌缺血再灌注時自噬活動的影響未見報道，因此本研究重點探討NECA對心肌缺血再灌注自噬調(diào)控的機制。本實驗通過建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型，觀察到I/R組心肌細胞損傷嚴重，有多處典型的自噬現(xiàn)象，說明心肌缺血再灌注損傷可以提高心肌細胞的自噬水平，這與Sciarretta等[1]的研究結(jié)果一致，證實了再灌注階段的過度自噬會加重心肌損傷。NECA組心肌細胞損傷明顯減輕，沒有自噬體的形成，僅有部分線粒體輕度水腫，推測NECA可能通過抑制心肌細胞的過度自噬而發(fā)揮心肌保護作用。

Beclin-1是一種關(guān)鍵的自噬蛋白，是自噬發(fā)生的始動因子，可調(diào)節(jié)自噬體的形成，直接反映自噬的發(fā)生程度[8]。有研究[1]證實，在心肌缺血再灌注損傷期間，Beclin-1表達升高標志自噬程序被過度激活，進而誘發(fā)細胞死亡。LC3是自噬相關(guān)蛋白，是自噬起始階段的一種特殊的分子標志物，LC3Ⅰ為未脂質(zhì)化的非活性狀態(tài)，LC3Ⅱ為脂質(zhì)化的活性狀態(tài)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ反映自噬的激活狀態(tài)[9]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷時LC3Ⅱ表達明顯上調(diào)，進而誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高，說明缺血再灌注能增加自噬的發(fā)生。與I/R組相比，NECA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低，說明NECA可通過降低缺血再灌注引起的大鼠心肌細胞自噬增高而發(fā)揮心肌保護作用。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(20090548)。

邢鳳梅(E-mail: 598461347@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.009

R331.3

A

1002-266X(2017)22-0028-03

2016-12-16)