聶容榮，潘泓華，文輝，楊華，曾偉星，譚親友，江偉，符文彬，齊立

(1中國(guó)人民解放軍第181中心醫(yī)院，廣西桂林 541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3廣東省中醫(yī)院)

電針刺激天樞穴對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠肺組織AQP-1表達(dá)的影響

聶容榮1,2，潘泓華1，文輝2，楊華2，曾偉星1，譚親友2，江偉2，符文彬3，齊立1

(1中國(guó)人民解放軍第181中心醫(yī)院，廣西桂林 541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3廣東省中醫(yī)院)

目的 觀察電針刺激天樞穴對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠肺組織AQP-1表達(dá)的影響。方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常電針組、模型組、電針模型組，各15只。正常對(duì)照組、正常電針組不做任何處理；模型組、電針模型組逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉制備急性重癥胰腺炎模型。正常電針組、電針模型組在模型制備成功2 h后，電針刺激大鼠天樞穴。造模8 h后，采用RT-PCR和免疫組化法分別檢測(cè)各組大鼠肺組織中AQP-1 mRNA、蛋白。結(jié)果 模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組和正常電針組(P均<0.05)，電針模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)高于模型組(P均<0.05)，正常對(duì)照組與正常電針組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 電針刺激天樞穴可升高急性重癥胰腺炎大鼠肺組織AQP-1的表達(dá)。

電針刺激；天樞穴；急性重癥胰腺炎；胰源性肺損傷；水通道蛋白-1

急性重癥胰腺炎(SAP)病情兇險(xiǎn)，且常并發(fā)急性肺損傷(ALI)加重病情。ALI主要病理特征為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛性損傷，全身炎癥反應(yīng)綜合征在肺部表現(xiàn)為肺部彌漫性滲出和難以用單純吸氧糾正的低氧血癥[1]。此種胰源性肺損傷的終末結(jié)局為呼吸窘迫綜合征，病死率高達(dá)50%～90%[2]，但其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明。水通道蛋白(AQP)作為膜主體內(nèi)在蛋白家族成員，具有使細(xì)胞膜水通透力提升的功能，能夠提供快速液體轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑。目前有關(guān)AQP在ALI或肺部炎癥中作用的研究主要集中在AQP-1和AQP-5。AQP-1主要在氣道周圍毛細(xì)血管、淋巴管及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和臟層胸膜間皮細(xì)胞上表達(dá)，參與多種肺損傷性炎癥病理過(guò)程[3,4]。中醫(yī)理論認(rèn)為，肺與大腸相表里，肺為嬌臟，陽(yáng)明腑實(shí)，大便不通極易導(dǎo)致肺失宣降而致肺損傷。電針對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)激以及炎性因子的釋放起調(diào)節(jié)作用[5]。天樞穴屬于足陽(yáng)明胃經(jīng)經(jīng)穴，同是大腸腑的募穴，“腑病取募”，電針刺激天樞穴有疏通腸腑、理氣通便作用。前期研究[6]表明，電針刺激可減輕肺損傷。2014年12月～2016年12月，本研究觀察了電針刺激天樞穴對(duì)SAP大鼠肺組織AQP-1表達(dá)的影響，探討電針刺激天樞穴減輕ALI的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量100～120 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫(20±2)℃，動(dòng)物及飼料購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。AQP-1抗體、免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自成都溶海生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將60只模型大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常電針組、模型組、電針模型組共4組，每組15只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h。模型組和電針模型組大鼠采用20 g/L水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹部剃毛，消毒術(shù)區(qū)皮膚，無(wú)菌條件下經(jīng)正中切口入腹。在10倍手術(shù)顯微鏡下以直徑為0.45 mm聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)胰腺膽管十二指腸乳頭開(kāi)口入胰膽管，同時(shí)在膽管出肝門(mén)處用小動(dòng)脈夾夾閉，用微量泵以0.04 mL/min速度穩(wěn)定勻速地逆行注射5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)，3～5 min內(nèi)注射完，后用動(dòng)脈夾夾閉近十二指腸的胰膽管10 min。待胰腺組織出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的出血水腫后，于膽胰管匯入十二指腸處、穿刺點(diǎn)近側(cè)端予以11-0絲線結(jié)扎，撤除2個(gè)動(dòng)脈夾、還納十二指腸入腹，逐層關(guān)腹[7]。正常對(duì)照組、正常電針組不做任何處理。

1.3 電針刺激方法 模型制備成功2 h后，電針刺激正常電針組和電針模型組大鼠天樞穴。天樞穴定位采用擬人比照法，取大鼠胸腹正中線上，以劍突為一定位點(diǎn)，以恥骨聯(lián)合上緣為另一定位點(diǎn)，兩者連線的上2/3與下1/3的交點(diǎn)處旁開(kāi)5 mm為天樞穴。用特制鼠架將大鼠固定后，穴位周圍剪去腹毛，皮膚常規(guī)消毒，用毫針針刺5 mm，接HANS-200A型電針儀，電流強(qiáng)度為0.8～1.3 mA，采用疏密波，2 Hz/15 Hz，治療15 min。

1.4 肺組織AQP-1 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。各組大鼠均于造模8 h后剖殺，取右肺組織，提取總RNA。AQP-1上游引物序列為5′-ATGGCCAGCGAAATCAAGAAG-3′，下游引物序列為5′-GATATCATCAGCATCCAGGTC-3′。β-actin引物序列上游為5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游為5′-CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后采用凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。以AQP-1 mRNA與內(nèi)參β-actin電泳條帶灰度值之比，作為AQP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 肺組織AQP-1蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法。取左肺組織常規(guī)脫水、包埋制成蠟塊。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用SP法按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400)，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

2 結(jié)果

模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組和正常電針組(P均<0.05)，電針模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)高于模型組(P均<0.05)，正常對(duì)照組與正常電針組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織AQP-1 mRNA、蛋白表達(dá)比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與正常電針組比較，bP>0.05；與模型組比較，cP<0.05。

3 討論

SAP患者一旦并發(fā)ALI其病情將迅速惡化，病死率高，預(yù)后較差，是臨床上比較棘手的疾病[8]。有研究[9]表明，細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放會(huì)引起胰源性肺損傷。AQP-1在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中含量相對(duì)較高[10,11]，肺水腫的嚴(yán)重程度與AQP-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[12,13]。上述研究表明AQP-1在調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡中可能起重要作用，參與了ALI肺水腫的發(fā)病過(guò)程[14,15]。本研究結(jié)果亦表明，與正常對(duì)照組及正常電針組比較，模型組大鼠肺組織中AQP-1水平降低。

胰源性肺損傷屬中醫(yī)學(xué)“心下痛、胃痛”范疇，胰肝相關(guān)、肝胃不和，脾胃運(yùn)化失常，痰濕內(nèi)生，陽(yáng)氣被遏，經(jīng)氣與腑氣運(yùn)行不通暢，不通則痛而發(fā)為本病[16]。中醫(yī)生理學(xué)認(rèn)為，肺失肅降，則陽(yáng)明經(jīng)大腸經(jīng)氣運(yùn)化失調(diào)，肺與大腸兩者互為表里，胰肝脾腸統(tǒng)屬消化系統(tǒng)，六腑以通為順，不通則使肺氣上逆，肅降失調(diào)，此時(shí)如采用通臟之法，清利大腸經(jīng)，則有益于肅降肺氣，恢復(fù)肺之宣降功能復(fù)常，肺又助于通調(diào)百脈，則諸癥可解[17]。由此可知，通過(guò)治大腸腑治療肺病思路有著充分的理論支持依據(jù)。

針灸是一種能夠充分激發(fā)人體自身潛力和調(diào)動(dòng)整體的調(diào)節(jié)方法，它主要通過(guò)各種物理化學(xué)方式(熱刺激、機(jī)械刺激、電刺激等)刺激人體相關(guān)腧穴，從而使經(jīng)絡(luò)之氣被激發(fā)，陰陽(yáng)協(xié)調(diào)，最終達(dá)到防治疾病的目的。針灸本身具備效之信，若風(fēng)之吹云的效果，取法得當(dāng)，可快速宣肺通腑，發(fā)揮治療作用。針刺作用的實(shí)驗(yàn)研究已然表明，針刺可充分調(diào)動(dòng)機(jī)體自身內(nèi)源性自限、品質(zhì)、雙向調(diào)節(jié)機(jī)能，維護(hù)機(jī)體自身功能平衡。天樞穴位本身屬于足陽(yáng)明胃經(jīng)，大腸的募穴，“腑病取募”，有天然通腑治療作用，是治療消化系統(tǒng)疾病最常用的穴位，對(duì)胃腸麻痹性腹脹、腹痛具有較好的臨床作用[18]，具備通腑保肺的有關(guān)作用[19,20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針模型組大鼠肺組織AQP-1水平較模型組升高，表明電針刺激天樞穴可上調(diào)SAP大鼠肺組織中AQP-1的表達(dá)，進(jìn)而減輕ALI。本研究結(jié)果對(duì)祖國(guó)針灸醫(yī)學(xué)的推廣應(yīng)用具有重要的臨床意義。

[1] 陳秋星,呂德超,曹斌,等.重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷危險(xiǎn)因素的臨床研究[J].肝膽胰外科雜志,2012,24(6):451-454，458.

[2] 趙翠娟,陳吉,崔宏,等.重癥急性胰腺炎合并肺損傷相關(guān)發(fā)病機(jī)制[J].國(guó)際消化病雜志,2014,34(5):320-322.

[3] Pastor CM, Matthay MA, Frossard JL. Pancreatitis-associated acute lung injury: new insights[J]. Chest, 2003,124(6):2341-2351.

[4] 孫燕妮,楊潔,承解靜,等.膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AQP-1、AQP-5表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2014,54(12):21-23.

[5] Li G, Li S, An L, et al. Electroacupuncture alleviates intraoperative immunosuppression in patients undergoing supratentorial craniotomy[J]. Acupunct Med, 2013,31(1):51-56.

[6] 黎暉,杜少輝,李伊為,等.電針內(nèi)關(guān)對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠模型肺組織中一氧化氮合酶活性的影響[J].上海針灸雜志,2003,22(11):3-6.

[7] 王鋒,黃鶴光,陸逢春,等.膽胰管結(jié)扎法制作大鼠胰源性肺損傷模型[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2012,19(1):25-30.

[8] 陳秋星,呂德超,曹斌,等.重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷危險(xiǎn)因素的臨床研究[J].肝膽胰外科雜志,2012,24(6):451-454.

[9]趙翠娟,陳吉,崔宏,等.重癥急性胰腺炎合并肺損傷相關(guān)發(fā)病機(jī)制[J].國(guó)際消化病雜志,2014,34(5):320-322。

[10] Kylnp L, Rakonczay Z Jr, O′Reilly DA. The clinical course of acute pancreatitis and the inflammatory mediators that drive it[J]. Int J Inflam, 2012,2012:360685.

[11] 劉笑玎,原銘貞,王司儀,等.水通道蛋白1、3、4和5與急性肺損傷關(guān)系的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,40(5):1119-1122.

[12] 李波,陳東,王桂芳,等.水通道蛋白1、3、4、5在內(nèi)毒素性急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(2):131-135.

[13] 謝艷萍,陳才平,王建春,等.急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5的表達(dá)及功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2005,28(6):385-389.

[14] 岳勝,朱平,岳磊,等.急性肺損傷大鼠呼吸膜AQP1和AQP5的表達(dá)[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2016,26(8):70-74，90.

[15] 劉笑玎,原銘貞,王司儀,等.水通道蛋白1、3、4和5與急性肺損傷關(guān)系的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,56(5):1119-1122.

[16] 韓恩昆,吳咸中.大承氣湯和活血清胰湯對(duì)重型急性胰腺炎肺損傷治療的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2004,10(2):28-30.

[17] 石占利,李國(guó)輝,孫靜,等.大黃素對(duì)重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷大鼠的干預(yù)作用[J/OL].中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志(電子版),2015,8(3):143-149.

[18] 王成偉,李寧,何洪波,等.電針雙側(cè)天樞穴對(duì)功能性便秘患者自覺(jué)癥狀的影響及療效滿意度評(píng)價(jià):一項(xiàng)單中心、前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)[J].針刺研究，2010,35(5):375-379.

[19] 聶容榮,袁晟光,劉杰,等.山姜素對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠肺損傷中水通道蛋白-1表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,35(18):5062-5064.

[20] 李雷兵,張琦.中醫(yī)藥關(guān)于水通道蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(9):1194-1195，1198.

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(YB2014273)。

齊立(E-mail： 21658135@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.012

R657.5

A

1002-266X(2017)22-0035-03

2017-01-09)