羊燕燕，裘娟萍，余志良

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

假交替單胞菌遺傳操作系統(tǒng)的研究進(jìn)展

羊燕燕，裘娟萍，余志良

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

假交替單胞菌能產(chǎn)生多種胞外活性物質(zhì)，賦予其重要的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究價值.目前已有多株假交替單胞菌完成基因組測序.基因組序列分析揭示不同的假交替單胞菌具有產(chǎn)生不同活性代謝產(chǎn)物的能力.假交替單胞菌遺傳操作體系欠成熟，這極大地限制了假交替單胞菌的研究與應(yīng)用.主要對近十多年來假交替單胞菌遺傳操作系統(tǒng)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，包括感受態(tài)制備，穿梭載體、自殺敲除載體及篩選標(biāo)記的成功應(yīng)用，以期為假交替單胞菌遺傳操作系統(tǒng)的發(fā)展提供參考.

假交替單胞菌；遺傳操作；接合轉(zhuǎn)移

假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)在分類學(xué)上屬于細(xì)菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、交替單胞菌目、交替單胞菌科、假交替單胞屬[1]，是一類好氧異養(yǎng)型、不產(chǎn)芽胞、具有鞭毛的革蘭氏陰性細(xì)菌，能產(chǎn)胞外多糖[2]、色素[3]、抗菌溶菌物質(zhì)[4]和胞外酶(如淀粉酶[5]、瓊膠酶[6])等多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)有抗菌溶菌、裂解藻類和降解瓊脂等多種生物學(xué)功能，在養(yǎng)殖業(yè)的生物防治[7]、赤潮治理[8]，在抗菌抗腫瘤新型海洋藥物的開發(fā)[9-10]及工業(yè)生產(chǎn)[11]等方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

生物體內(nèi)代謝途徑控制著細(xì)胞活性物質(zhì)的產(chǎn)生，了解和掌握活性物質(zhì)的代謝途徑及調(diào)控機(jī)理對活性物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)十分重要.因此，構(gòu)建一套適用于假交替單胞菌的遺傳操作系統(tǒng)(利用基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)[12])是開發(fā)利用假交替單胞菌活性物質(zhì)極為重要的基礎(chǔ)工作.目前，部分假交替單胞菌全基因組序列已測定，這為遺傳操作體系的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)，但豐富的耐多藥抗性基因、藥物流出泵及遺傳修飾體系的存在導(dǎo)致假交替單胞菌遺傳操作還不是很成功[13]，這限制了在分子水平對該類細(xì)菌的改造，從而影響了對假交替單胞菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的機(jī)制及調(diào)控機(jī)理的深入研究.遺傳操作是指在體外將目的DNA片段連接到載體上，形成重組DNA，并將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)或沉默宿主特定基因的過程，涉及到的操作主要有感受態(tài)制備、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化方法和篩選標(biāo)記的選擇等.經(jīng)過十多年研究，假交替單胞菌遺傳操作系統(tǒng)研究已有一定進(jìn)展，筆者主要從感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化方法、載體構(gòu)建和篩選標(biāo)記的選擇等方面對其遺傳操作體系的研究進(jìn)展進(jìn)行概述.

1 感受態(tài)細(xì)胞的制備

細(xì)胞感受態(tài)是指細(xì)菌具遺傳轉(zhuǎn)化的能力，即通過理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài).目前鮮有假交替單胞菌感受態(tài)制備的相關(guān)研究報道.Kurusu等[14]將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Pseudoalteromonassp. PS1M3離心取菌體，用10 mL含7 mmol/L N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)和252 mmol/L蔗糖(pH 7.0)的緩沖液洗滌、重懸菌體兩次，最后將菌體用同種緩沖液懸浮成100 μL體積的感受態(tài)細(xì)胞.Zhao等[15]將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞離心取菌體，用預(yù)冷的ddH2O洗滌、重懸菌體兩次，最后用100 μL含20 mmol/L葡萄糖的ddH2O重懸，成功制備Pseudoalteromonassp. Bsi20429感受態(tài)細(xì)胞.此外，筆者借鑒普通大腸桿菌和枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備條件，在感受態(tài)制備過程中使用高滲溶液作為電擊緩沖液以保護(hù)嗜鹽的假交替單胞菌.取Pseudoalteromonassp. R3對數(shù)生長期細(xì)胞，用10 mL含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L的甘露醇和體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油的預(yù)冷緩沖液A洗滌、重懸R3菌體兩次，用10 mL含0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L的甘露醇和體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油的緩沖液B洗滌一次，最后用100 μL緩沖液B重懸，制備R3感受態(tài)細(xì)胞.加復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇2 h后，涂布平板培養(yǎng)，結(jié)果平板上有305 個菌落生長，說明該方法可以用于制備R3感受態(tài)細(xì)胞.

2 假交替單胞菌遺傳操作載體

2.1 穿梭載體

穿梭載體是將兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子整合在一個質(zhì)粒上，以期能在兩個不同的菌種中實(shí)現(xiàn)復(fù)制和異源表達(dá).目前，與假交替單胞菌有關(guān)的穿梭載體都是大腸桿菌-假交替單胞菌系列，包括CloneQ，pPACE1，pWD和pOriT-4Em.

2.1.1 質(zhì)粒CloneQ

2001年，Tutino等[16]在游海假交替單胞菌PseudoalteromonashaloplanktisTAC 125中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源質(zhì)粒pMtBL，大小為4 081 bp.將其最小復(fù)制單元片段ARS克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pGEM-T上，構(gòu)建了4.7 kb的大腸桿菌-假交替單胞菌穿梭載體CloneQ，并利用該穿梭載體在嗜冷假交替單胞菌中異源表達(dá)了α-淀粉酶基因.

2.1.2 質(zhì)粒pPACE1

2001年，Kurusu等[14]在Pseudoalteromonassp. PS1M3中獲得了大小為3.1 kb的內(nèi)源質(zhì)粒pPS1M3.在該質(zhì)粒上插入大腸桿菌pHSG99載體的復(fù)制起始(ori)和氯霉素、紅霉素抗性基因，獲得了大小為7.0 kb的大腸桿菌-假交替單胞菌穿梭載體pPACE1.研究者將該穿梭載體成功導(dǎo)入到消除了內(nèi)源質(zhì)粒的Pseudoalteromonassp. PS1M13菌中，實(shí)現(xiàn)了氯霉素、紅霉素雙抗重組菌的穩(wěn)定傳代[15].

2.1.3 質(zhì)粒pWD系列

Zhao等[15]從Pseudoalteromonassp. Bsi20429中獲得內(nèi)源性質(zhì)粒pSM429，測序發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒包含4個開放閱讀框.將4個開放閱讀框隨機(jī)組合克隆至pUC19質(zhì)粒，同時加入大腸桿菌pBR322質(zhì)粒復(fù)制起始(pBR322 origin)和氯霉素抗性標(biāo)記，構(gòu)建了含有不同開放閱讀框的系列大腸桿菌-假交替單胞菌穿梭載體(pWD1～pWD6).將不同穿梭載體電轉(zhuǎn)化至已消除內(nèi)源性質(zhì)粒的Pseudoalteromonassp. Bsi20429中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4號開放閱讀框是pSM429質(zhì)粒的最小復(fù)制單元，而1號和2號開放閱讀框在pSM429質(zhì)粒穩(wěn)定中起重要作用.隨后，研究者利用構(gòu)建的穿梭載體pWD2，在Pseudoalteromonassp. Bsi20429中成功表達(dá)了紅霉素抗性基因和纖維素降解酶基因.Wang等[13]發(fā)現(xiàn)將pWD2穿梭載體導(dǎo)入到9株不同假交替單胞菌中的轉(zhuǎn)化效率為10-6～10-3.

2.1.4 pOriT-4Em

Yu等[17]將接合轉(zhuǎn)移起始o(jì)riT、質(zhì)粒pUZ8002在E.coliDH5α中復(fù)制的元件phage f1及pSM429質(zhì)粒上的repA復(fù)制起始連接到pWD2，構(gòu)建了大小為6 702 bp的大腸桿菌-假交替單胞菌穿梭載體pOriT-4Em，研究者將其導(dǎo)入Pseudoalteromonassp. SM9913，轉(zhuǎn)化效率為1.8×10-3.

2.2 自殺性敲除質(zhì)粒

自殺質(zhì)粒的性質(zhì)是復(fù)制時需要一種特殊蛋白，即協(xié)助復(fù)制起始的蛋白，大多數(shù)細(xì)菌不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，因此當(dāng)自殺質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞時，不能以游離的方式復(fù)制，只能整合到受體細(xì)胞染色體上隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，自殺質(zhì)粒的這個特點(diǎn)常用于基因的敲除.

將構(gòu)建的基因缺失片斷克隆至自殺質(zhì)粒，在抗性選擇壓力下，利用缺失基因兩端的同源片斷，自殺質(zhì)粒被迫整合到基因組上發(fā)生第1輪單交換.再在第2輪反篩選壓力下得到發(fā)生第2輪單交換的敲除子.因此自殺性敲除質(zhì)粒一般包括5個元件：1) 能啟動在供體菌復(fù)制而不能啟動在受體菌復(fù)制的復(fù)制起始[17-22]；2) 用于第1輪正向篩選的抗性標(biāo)記；3) 用于第2輪反篩選的標(biāo)記；4) 與染色體上欲敲除基因上下游具有一定同源性的融合片段；5) 用于可誘導(dǎo)供體菌和受體菌接合轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移酶基因tra和接合轉(zhuǎn)移起始o(jì)riT[13,17].目前報道的關(guān)于假交替單胞菌基因敲除的自殺質(zhì)粒均包括以上5個元件.自殺敲除載體的圖譜歸納見圖1，兩輪同源重組敲除示意圖歸納見圖2.

圖1 自殺敲除載體示意圖Fig.1 The map of suicide knock-out vector

圖2 兩輪同源重組敲除示意圖[13]Fig.2 Schematic of the two rounds recombination event

2.2.1 質(zhì)粒pVS

Parrill等[18]將廣泛宿主克隆載體pJB3[23]上oriT位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pGEM-7z，構(gòu)建pGEM7Z-oriT質(zhì)粒；再以克隆載體pKSS[24]為模板獲得pheSGly294反篩選標(biāo)志，克隆至pPM13質(zhì)粒[25]，獲得pPM13-pheSGly294質(zhì)粒，并以此質(zhì)粒為模板克隆P13嗜冷啟動子及pheSGly294基因至pGEM7Z-oriT質(zhì)粒，最終構(gòu)建了自殺載體pVS.Parrilli等[26-27]利用這個自殺質(zhì)粒，通過β-內(nèi)酰胺酶(betalactamase，blaM)和pheSGly294基因作為正負(fù)篩選標(biāo)記，構(gòu)建了假交替單胞菌TAC125的蛋白酶分泌途徑中g(shù)spE基因缺失的突變株(P.haloplanktisTAC125::VSgspE)，導(dǎo)致突變株TAC125胞外蛋白酶活性降低，從而避免表達(dá)的外源重組蛋白被降解.

2.2.2 質(zhì)粒pMT

Yu等[17]酶切假交替單胞菌-大腸桿菌的穿梭載體pOriT-4Em，將repA片段移除，加入Ery抗性基因和sacB反篩選標(biāo)記，構(gòu)建了自殺穿梭敲除載體pMT，將其導(dǎo)入Pseudoalteromonassp. SM9913中，敲除了菌株SM9913中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsT和與鞭毛運(yùn)動性有關(guān)調(diào)控蛋白基因及2個極生鞭毛蛋白絲基因.

2.2.3 質(zhì)粒pK18mobsacB-Ery和pK18mobsacB-Cm

Wang等[13]將紅霉素Ery基因和氯霉素Cm基因克隆到自殺質(zhì)粒pK18mobsacB[28]中，構(gòu)建了pK18mobsacB-Ery和pK18mobsacB-Cm敲除質(zhì)粒，成功敲除了PseudoalteromonasrubraDSM6842中靈菌紅素生物合成基因pigM-K，Pseudoalteromonassp. SM9913中編碼生物膜和運(yùn)動性基因bsmA，PseudoalteromonaslipolyticaSCSIO04301中編碼尿黑酸1,2-雙脫氧酶基因hmgA和Pseudoalteromonassp. SCSIO11900 中編碼鞭毛馬達(dá)蛋白基因fliFG[13].此外，pAK405[29]和pCVD442[30]也常用于革蘭氏陰性菌的基因敲除，但至今還沒有用于假交替單胞菌的成功報道.綜上，已成功運(yùn)用的穿梭載體都是將特定的假交替單胞菌的復(fù)制元件與大腸桿菌的復(fù)制起始克隆入載體，因此是特定假交替單胞菌專用的穿梭載體.而自殺敲除載體是假交替單胞菌及其他種屬通用的敲除載體.

3 重組DNA轉(zhuǎn)化方法

有效的轉(zhuǎn)化方法是實(shí)現(xiàn)外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的基礎(chǔ)[31].細(xì)菌常用的轉(zhuǎn)化方法有：自然轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化、熱激轉(zhuǎn)化和種間接合轉(zhuǎn)移等.目前成功應(yīng)用于假交替單胞菌遺傳操作的轉(zhuǎn)化方法主要有電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移，特別是接合轉(zhuǎn)移成功案例更多.因此接合轉(zhuǎn)移是假交替單胞菌通用的轉(zhuǎn)化方法，而電轉(zhuǎn)化方法比較局限，可能是部分假交替單胞菌專用.

3.1 接合轉(zhuǎn)移及成功案例

接合轉(zhuǎn)移是指兩細(xì)菌細(xì)胞直接接觸，供體細(xì)胞中的F質(zhì)粒將其攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程.F質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體菌依賴于接合轉(zhuǎn)移起始o(jì)riT和轉(zhuǎn)移區(qū)tra[32]，tra區(qū)編碼一個DNA松弛酶，識別、結(jié)合到oriT位點(diǎn)，切開質(zhì)粒的一條鏈，并共價結(jié)合到轉(zhuǎn)移鏈的5′端形成單鏈DNA，游離的單鏈DNA通過細(xì)胞膜IV型分泌系統(tǒng)(Type 4 secretion system，T4SS)進(jìn)入宿主菌后形成雙鏈DNA并在宿主中穩(wěn)定傳代.由于轉(zhuǎn)移的片段是單鏈DNA，故可以減少受體菌限制修飾系統(tǒng)對它的降解，提高轉(zhuǎn)化效率[32].

Tutino等[16]在2001年將外源敲除質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入P.haloplanktisTAC125，成功構(gòu)建胞外蛋白酶活性降低的P.haloplanktisTAC125突變株.2004年，Duilio等[20]通過接合轉(zhuǎn)移將帶有P.haloplanktisA23的α-淀粉酶的重組質(zhì)粒在P.haloplanktis中實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的異源表達(dá).Egan等[33-34]通過接合轉(zhuǎn)移將Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入假交替單胞菌基因組中，成功構(gòu)建色素和抗真菌物質(zhì)突變體庫.此外，2010年本實(shí)驗(yàn)室在產(chǎn)L-氨基酸氧化酶的調(diào)控機(jī)理研究中也通過接合轉(zhuǎn)移成功將Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入Pseudoalteromonassp. Rf-1基因組上[35].

3.2 電轉(zhuǎn)化及成功案例

相對于接合轉(zhuǎn)移，假交替單胞菌電轉(zhuǎn)化方法研究較少.電轉(zhuǎn)化是利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜上形成納米孔大小的微孔，將DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中[36].2001年，Kurusu等[14]首次將電轉(zhuǎn)化應(yīng)用于假交替單胞菌中，7 mmol/L N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)和252 mmol/L蔗糖組成pH 7.0的電擊緩沖液，在電壓2 000 V/cm、電阻200 Ω、電容量50 μF的電擊條件下，成功將他們自己構(gòu)建的穿梭載體pPACE1導(dǎo)入消除了內(nèi)源性質(zhì)粒的Pseudoalteromonassp. PS1M13中，實(shí)現(xiàn)了重組菌的穩(wěn)定傳代.2011年，Zhao等[15]以含有20 mmol/L葡萄糖雙蒸水溶液為電擊緩沖液，成功將質(zhì)粒pWD2電擊導(dǎo)入已消除內(nèi)源性質(zhì)粒的Pseudoalteromonassp. Bsi20429中，并成功表達(dá)了質(zhì)粒攜帶的紅霉素抗性基因和纖維素降解酶基因[15].此后，Wang等[13]利用載體pWD2，嘗試通過電轉(zhuǎn)化的方法在其他假交替單胞菌中進(jìn)行基因敲除，但因轉(zhuǎn)化效率太低，基因敲除并未成功.

4 轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記

合適有效的篩選標(biāo)記有助于快速獲得目的轉(zhuǎn)化子.已報道可用于假交替單胞菌遺傳操作的篩選有正向篩選(抗性篩選)和兩輪同源重組敲除的反向篩選.

4.1 正向篩選

抗生素抗性標(biāo)記是常用的轉(zhuǎn)化子篩選方法.篩選原理是在抗生素平板上只有發(fā)生轉(zhuǎn)化而獲得外源抗性基因的轉(zhuǎn)化子才能在該種抗生素選擇壓力下生長，未發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長.

4.1.1 青霉素類抗性標(biāo)記

Parrilli等[26-27]等在研究構(gòu)建P.haloplanktisTAC125突變株工作中將羧芐青霉素(carbenicillin，Car)、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)作為抗性篩選標(biāo)記，在30 μg/mL Car和100 μg/mL Amp抗性平板上實(shí)現(xiàn)了P.haloplanktisTAC125重組子的篩選.

4.1.2 氯霉素、紅霉素抗性標(biāo)記

2015年，Wang等[13]對9株假交替單胞菌進(jìn)行抗生素抗性研究，發(fā)現(xiàn)9株親株對25 μg/mL紅霉素(erythromycin，Ery)和30 μg/mL氯霉素(chloramphenicol，Cm)均敏感，在基因敲除研究中以Ery為標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)化子P.rubraDSM 6842,P.lipolyticaSCSIO 04301.以Cm為標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)化子P. sp. SM 9913,P. sp. SCSIO 11900.

4.1.3 正向篩選的缺點(diǎn)

由于假交替單胞菌存在豐富的耐多藥抗性基因和藥物流出泵，抗生素抗性篩選在假交替單胞菌中易失效[13].因此，選擇合適的抗性篩選標(biāo)記非常重要.

4.2 反向篩選

反向篩選一般適用于兩輪同源重組的遺傳操作體系的第2輪篩選.反篩選標(biāo)記是指在第1輪正向篩選的基礎(chǔ)上增加1輪篩選壓力，第1輪轉(zhuǎn)化子在相應(yīng)反篩選物質(zhì)的平板上不能生長，只有發(fā)生第2輪基因重組，將反篩選標(biāo)記丟失的轉(zhuǎn)化子才能生長.常見的反篩選標(biāo)記有：sacB基因(編碼果聚糖蔗糖酶)[13,37]和pheSGly294基因(編碼苯丙氨酸-tRNA合酶基因的突變體)[27,37].反篩選圖示歸納見圖3.

圖3 反篩選圖示Fig.3 Schematic of counter select

4.2.1sacB反篩選標(biāo)記

sacB反篩選的原理：sacB編碼蔗糖果聚糖酶，具有蔗糖水解酶和果糖轉(zhuǎn)移酶雙重活性，蔗糖水解酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，果糖轉(zhuǎn)移酶催化果糖合成果聚糖[38]，果聚糖對革蘭氏陰性菌具毒害作用，毒害機(jī)制還不清楚[39].當(dāng)培養(yǎng)基中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖時，蔗糖果聚糖酶催化蔗糖水解并最終合成果聚糖，導(dǎo)致菌體死亡，故帶有sacB基因的第1輪轉(zhuǎn)化子在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖平板上不生長而發(fā)生第2輪重組后將sacB基因丟失的轉(zhuǎn)化子能生長.

4.2.2pheSGly294反篩選標(biāo)記

pheSGly294反篩選的原理：當(dāng)pheS編碼的Phe-tRNA合酶的第294位氨基酸突變成甘氨酸后，Phe-tRNA合酶的α亞基發(fā)生突變，突變后的酶對底物特異性會降低，使得有毒的苯丙氨酸類似物氯苯丙氨酸(pCl-Phe)也能被利用，從而致死宿主菌[37,40].因此往培養(yǎng)基中添加氯苯丙氨酸，帶有pheSGly294基因第1輪轉(zhuǎn)化子不生長，只有發(fā)生第2輪重組將pheSGly294基因丟失的轉(zhuǎn)化子能生長.

4.2.3 反向篩選的缺點(diǎn)

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)sacB和pheSGly294作為反篩選標(biāo)記存在缺點(diǎn)[29].sacB反篩選的缺點(diǎn)是會發(fā)生高頻率的對果聚糖有抗性的自發(fā)突變事件，使得第1輪重組子也能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖平板上生長；而pheSGly294反篩選的缺點(diǎn)是培養(yǎng)基中pCl-Phe的添加對受體細(xì)胞具損傷作用.

5 結(jié) 論

近15年來，隨著假交替單胞菌內(nèi)源性質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)、最小復(fù)制單元的分離和測序，假交替單胞菌遺傳操作體系的研究已取得較大進(jìn)展，包括電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，穿梭質(zhì)粒、敲除質(zhì)粒和篩選標(biāo)記的成功應(yīng)用.但假交替單胞菌遺傳操作體系還存在可以改進(jìn)或完善的地方，比如，自殺敲除載體復(fù)制起始位點(diǎn)可能不夠嚴(yán)謹(jǐn)；兩輪同源重組敲除的反篩選標(biāo)記有局限性，它們或在第2輪反篩選添加濃度下，第1輪突變子依舊生長，或在低于第2輪反篩選10倍添加濃度下依然能致死宿主菌.近來，Julia等[29]為了避免鞘酯單胞菌中sacB，pheSGly294兩個反篩選標(biāo)記存在的缺陷，使用了rpsL(鏈霉素反篩選標(biāo)記)作為反篩選標(biāo)記，成功實(shí)現(xiàn)了鞘酯單胞菌Sphingomonassp. Fr1中編碼響應(yīng)調(diào)節(jié)子基因phyR、選擇性σ因子σEcfG、番茄紅素環(huán)化酶基因crtY和八氫番茄紅素脫氫酶基因crtI的敲除.這個反篩選標(biāo)記有望在假交替單胞菌中應(yīng)用.另外，轉(zhuǎn)化方式的局限極大地限制了假交替單胞菌遺傳操作體系的應(yīng)用，摸索行之有效的轉(zhuǎn)化體系極為迫切.近年來興起的以RNA為向?qū)У腃as9[41]的敲除手段也有望運(yùn)用于假交替單胞菌.隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，通過針對性的基因修改，探究假交替單胞菌活性代謝產(chǎn)物的代謝途徑和調(diào)控機(jī)理，將為假交替單胞菌來源的活性產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)[42].

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Advances in genetic manipulation onPseudoalteromonas

YANG Yanyan, QIU Juanping, YU Zhiliang

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Pseudoalteromonaswas ubiquitous in environments and can produce diverse bioactive compounds. So far, severalPseudoalteromonasisolates have been sequenced and the bioinformatics analysis has revealed their abilities to produce different bioactive compounds. However, the lack of genetic manipulation system ofPseudoalteromonasgreatly restricted their applications and studies at molecular level. Here, we describe the advances in genetic manipulation onPseudoalteromonas, including the preparation of competent cells, the successful application of shuttle vectors, suicide knockout vectors and screening markers, which provide the reference for the development of genetic manipulation system inPseudoalteromonas.

Pseudoalteromonas; genetic manipulation; conjugation

2017-03-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(31670114)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY16C010002)；國家海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目(12PYY001SF08)

羊燕燕(1992—)，女，浙江磐安人，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)，E-mail: 2111405109@zjut.edu.cn. 通信作者：余志良副教授，E-mail: zlyu@zjut.edu.cn.

Q933

A

1674-2214(2017)02-0100-07