白雪梅，劉德龍，魏永巨（河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

三維熒光光譜結(jié)合交替三線性分解算法測定徐長卿藥材中丹皮酚的含量Δ

白雪梅＊，劉德龍#，魏永巨（河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

目的：采用三維熒光光譜結(jié)合交替三線性分解（ATLD）算法測定徐長卿藥材中丹皮酚的含量。方法：構(gòu)建三線性模型，利用最小二乘原理進(jìn)行ATLD，采用核一致診斷法對(duì)體系的組分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，采用數(shù)學(xué)校正法校正內(nèi)濾光效應(yīng)。三維熒光光譜掃描條件：激發(fā)波長范圍為250～400 nm，發(fā)射波長范圍為410～600 nm，波長間隔為5 nm，狹縫寬度為5.0/5.0 nm，掃描速度為1 200 nm/m in；測定吸收光譜條件：掃描波長范圍為250～600 nm，掃描速度為600 nm/m in；以A l（Ⅲ）作敏化劑增強(qiáng)丹皮酚的熒光強(qiáng)度。以高效液相色譜法（HPLC）測定藥材樣品中丹皮酚含量作為驗(yàn)證。結(jié)果：丹皮酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.132～1.188μg/m L（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率為100.1%～104.7%（RSD＝2.39%，n＝9）；丹皮酚的解析光譜與其真實(shí)光譜幾乎完全重合。HPLC測定結(jié)果與ATLD算法結(jié)果十分相近。結(jié)論：三維熒光光譜結(jié)合ATLD算法簡便、快速、高效、準(zhǔn)確，可用于復(fù)雜體系中特定組分的定性與定量分析。

三維熒光光譜；交替三線性分解算法；徐長卿；丹皮酚；高效液相色譜法

徐長卿Cynanchum paniculatum為中醫(yī)常用藥材[1]。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要有效成分為丹皮酚。丹皮酚能鎮(zhèn)靜、抗菌、降血壓，還可抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗抑郁[2-4]。丹皮酚含量是徐長卿藥材質(zhì)量的重要衡量指標(biāo)，因此測定徐長卿藥材中丹皮酚含量具有重要的價(jià)值。目前，丹皮酚含量的測定方法主要有氣相色譜法[5-6]、近紅外光譜法[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8-10]、紫外分光光度法[11]等，尚未見利用三維熒光光譜進(jìn)行測定的報(bào)道。為此，本課題組采用三維熒光光譜結(jié)合交替三線性分解（ATLD）算法測定了藥材樣品中丹皮酚的含量，并采用HPLC法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料

1.1 儀器

F-4600型熒光分光光度計(jì)（用1 cm石英比色皿掃描激發(fā)-發(fā)射三維熒光光譜）、U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)（用1 cm石英比色皿掃描吸收光譜）均購自日本Hitachi公司；1260型HPLC儀（美國Agilent公司）；AUY220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；868型pH酸度計(jì)（美國Orion公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40 kHz）；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器（金壇市丹陽門石英玻璃廠）。

1.2 試劑

丹皮酚對(duì)照品（成都指標(biāo)化純生物科技有限公司，批號(hào)：14016，純度：＞98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

徐長卿藥材（購自石家莊樂仁堂大藥房）經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院中藥炮制實(shí)驗(yàn)室高艷芝主管技師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理

2.1.1 三線性模型 在選定的I個(gè)激發(fā)波長、J個(gè)發(fā)射波長下對(duì)K個(gè)樣本進(jìn)行三維熒光光譜掃描，得到一系列的熒光光譜矩陣，并收集在一個(gè)大小為I×J×K的三維數(shù)據(jù)陣X中，xijk表示這個(gè)三維數(shù)據(jù)陣中的元素，用數(shù)學(xué)式[12-13]表達(dá)如下：

其中，ain、bjn、ckn分別是大小為I×N的相對(duì)激發(fā)光譜矩陣A、大小為J×N的相對(duì)發(fā)射光譜矩陣B和大小為K× N的相對(duì)濃度矩陣C中的元素；eijk是大小為I×J×K的殘差陣E中的元素。N代表組分?jǐn)?shù)，即對(duì)熒光作出貢獻(xiàn)的總組分?jǐn)?shù)，包括感興趣組分和背景干擾。

2.1.2 ATLD算法 ATLD算法利用最小二乘原理，根據(jù)以下迭代公式，并引入Moor-Penrose廣義逆計(jì)算[14]，對(duì)矩陣A、B、C進(jìn)行迭代求解：

2.1.3 核一致診斷法 在二階校正法的計(jì)算過程中，采用核一致診斷法對(duì)體系的組分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，使其與實(shí)際組分?jǐn)?shù)更接近，使計(jì)算更準(zhǔn)確。通過計(jì)算核一致值來確定體系的組分?jǐn)?shù)，通常情況下，當(dāng)核一致值≥60%時(shí)，認(rèn)為模型接近三線性；當(dāng)核一致值＜60%時(shí)，則認(rèn)為模型偏離三線性[15]。

2.1.4 內(nèi)濾光校正 內(nèi)濾光效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致熒光光譜矩陣偏離三線性，當(dāng)溶液吸光度＞0.05時(shí)，需要進(jìn)行校正。主要的校正方法有稀釋法和數(shù)學(xué)校正法[16]。本課題組采用數(shù)學(xué)校正法，根據(jù)I0＝I×100.5×b（Aex+Aem）對(duì)溶液吸光度進(jìn)行校正，其中I0是校正后的熒光強(qiáng)度，I是校正前的熒光強(qiáng)度，Aex和Aem分別是激發(fā)和發(fā)射波長處的吸光度，b是比色皿厚度。

2.2 三維熒光光譜結(jié)合ATLD算法測定藥材樣品中丹皮酚含量

2.2.1 試驗(yàn)條件 進(jìn)行三維熒光光譜掃描時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長范圍為250～400 nm，發(fā)射波長范圍為410～600 nm，波長間隔為5 nm，狹縫寬度為5.0/5.0 nm，掃描速度為1 200 nm/m in；測定吸收光譜時(shí)，設(shè)置掃描波長范圍為250～600 nm，掃描速度為600 nm/m in。

2.2.2 丹皮酚的光譜特點(diǎn)及影響因素 丹皮酚自身幾乎沒有熒光，用Al（Ⅲ）作敏化劑后其熒光強(qiáng)度明顯增加（見圖1）。結(jié)果表明，當(dāng)Al（Ⅲ）溶液濃度達(dá)到0.02 mol/L以上，溶液pH約為4.40時(shí)，丹皮酚的光譜性質(zhì)較穩(wěn)定。因此，確定Al（Ⅲ）溶液濃度為0.05mol/L，選擇pH 4.46的醋酸-醋酸鈉緩沖液。

2.2.3 組分?jǐn)?shù)估計(jì) 利用核一致診斷法估計(jì)待測體系的組分?jǐn)?shù)N。當(dāng)N＝1和2時(shí)，核一致值為100%；當(dāng)N＝3時(shí)，核一致值下降到56%。因此，選擇體系組分?jǐn)?shù)為2，一個(gè)組分對(duì)應(yīng)于丹皮酚，另一個(gè)組分對(duì)應(yīng)于藥材樣品中一個(gè)干擾成分。

2.2.4 丹皮酚的解析光譜及定性分析 用ATLD算法解析三維熒光光譜數(shù)據(jù)陣得藥材樣品中丹皮酚的相對(duì)激發(fā)光譜（見圖2A）和相對(duì)發(fā)射光譜（見圖2B）。

圖1 三維熒光光譜（c＝0.924μg/m L）Fig 1 Three-dimensional fluorescence spectrum（c＝0.924μg/m L）

圖2 藥材樣品中丹皮酚的光譜Fig 2 Spectrum ofpaeonol in samples

結(jié)果表明，ATLD算法解析得到的藥材樣品中丹皮酚的解析光譜與其真實(shí)光譜幾乎完全重合，說明這種方法用于定性分析是可靠的。同時(shí)也可看出，在藥材樣品中有一種干擾成分的熒光光譜與丹皮酚發(fā)生嚴(yán)重重疊。

2.2.5 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確稱取對(duì)照品3.3mg，加水溶解制成丹皮酚質(zhì)量濃度為33μg/m L的對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液。將藥材樣品粉碎（過60目篩），準(zhǔn)確稱取50mg，以水浸泡過夜（12 h）后濾過，定容至50m L，得質(zhì)量濃度為1.0mg/m L的供試品溶液。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別置于10m L量瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液2m L、Al（Ⅲ）溶液1m L、氯化鈉溶液1m L，加水定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.132、0.396、0.660、0.924、1.188μg/m L的系列對(duì)照品溶液（C1～C5）。按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件對(duì)上述系列對(duì)照品溶液分別進(jìn)行三維熒光光譜掃描，記錄熒光強(qiáng)度。以丹皮酚質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得丹皮酚回歸方程y＝290.87x+6.42（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，丹皮酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.132～1.188μg/m L。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 分別取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別置于10m L量瓶中，加緩沖液2m L、A l（Ⅲ）溶液1m L、氯化鈉溶液1m L，加水定容，得溶液E1～E5（質(zhì)量濃度均為30μg/m L），作為平行預(yù)測集。分別取“2.2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，分別兩兩置于10m L量瓶中，加入緩沖液2m L、A l（Ⅲ）溶液1m L、氯化鈉溶液1m L，加水定容，得溶液E6～E10（對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.132、0.264、0.396、0.528、0.660μg/m L），作為標(biāo)準(zhǔn)加入集。取上述溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄熒光強(qiáng)度，并按“2.1.4”項(xiàng)下計(jì)算方法校正。結(jié)果，丹皮酚平均含量的RSD＝0.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液適量，置于10m L量瓶中，加緩沖液2m L、Al（Ⅲ）溶液1m L、氯化鈉溶液1m L，加水定容，分別于室溫下放置10、20、30、50、60、80、100、120min時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄熒光強(qiáng)度。結(jié)果，丹皮酚熒光強(qiáng)度的RSD＝2.77%（n＝8），表明供試品溶液室溫下放置120 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 以“2.2.3”項(xiàng)下溶液C1～C5為校正樣；分別取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別置于10m L量瓶中，加緩沖液2m L、Al（Ⅲ）溶液1m L、氯化鈉溶液1m L，加水定容，得溶液P1～P5（系列質(zhì)量濃度），作為待測樣。取上述溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄熒光強(qiáng)度并計(jì)算含量，并按“2.1.4”項(xiàng)下計(jì)算方法校正。結(jié)果，丹皮酚平均含量為1.16μg/m L，RSD＝0.03%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品0.3m L，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的丹皮酚對(duì)照品，按“2.2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄熒光強(qiáng)度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝9）

2.2.11 藥材樣品含量測定 以“2.2.3”項(xiàng)下溶液C1～C5為校正樣，“2.2.9”項(xiàng)下溶液P1～P5為待測樣，按“2.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄熒光強(qiáng)度并按“2.1.4”項(xiàng)下計(jì)算方法校正，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)（HPLC法）

3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50，V/V）；流速：1m L/m in；檢測波長：270 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：15μL。

3.2 專屬性試驗(yàn)

取“2.2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖3。結(jié)果，對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間為9.405m in，而藥材樣品在9.406m in出現(xiàn)色譜峰。

表2 藥材樣品含量測定結(jié)果（n＝6）Tab 2 Contentdeterm ination ofsamples（n＝6）

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatography

3.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、7.5、10、12.5、15μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以丹皮酚進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程y＝4 606.5x－2.5（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，丹皮酚檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.165～0.495μg。

3.4 方法學(xué)考察

按相關(guān)方法學(xué)要求進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果，上述試驗(yàn)中丹皮酚的RSD分別為0.86%（n＝6）、1.83%（n＝3）、0.83%（n＝5），表明儀器精密度良好，供試品溶液室溫下放置3 d內(nèi)基本穩(wěn)定，本方法重復(fù)性良好。

3.5 樣品含量測定

取藥材樣品適量，分別按“2.2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，藥材樣品中丹皮酚平均含量為1.12%（n＝31），與三維熒光光譜結(jié)合ATLD算法的測定結(jié)果十分相近。

4 討論

本試驗(yàn)分別采用三維熒光光譜結(jié)合ATLD算法和HPLC法測定了徐長卿藥材中丹皮酚的含量，兩種方法得到的結(jié)果基本一致?；贏TLD算法經(jīng)校正能在干擾共存的條件下對(duì)一種或幾種目標(biāo)分析物進(jìn)行同時(shí)解析測定，對(duì)于成分復(fù)雜的中藥中有效成分研究是一種很好的方法，避免了煩瑣的預(yù)分離步驟，實(shí)現(xiàn)了快速、簡便、準(zhǔn)確的定量測定，在其他復(fù)雜體系的定性與定量分析研究中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Content Determ ination of Paeonol in Cynanchum paniculatum by Three-dimensional Fluorescence Coupled w ith ATLD Algorithm

BAIXuemei，LIU Delong，WEIYongju（College of Chem istry and Material Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China）

OBJECTIVE：To determ ine the content of paeonol in Cynanchum paniculatum by three-dimensional fluorescence coupled w ith ATLD algorithm.METHODS：The trilinearmodel was established.The principle of least square was used for ATLD. The component value was fitted by core consistency diagnosis，and inner filter effect was corrected by mathematical correction method.Fluorescence scanning condition included excitation wavelength of 250-400 nm，emission wavelength of 410-600 nm，wavelength interval of 5 nm，slit w idth of 5.0/5.0 nm，scanning speed of 1 200 nm/m in.Determ ination and absorption spectrum condition included scanning wavelength of 250-600 nm，scanning speed of 600 nm/m in；A l（Ⅲ）was used as the sensitizer to increase the fluorescence intensity of paeonol.The content of paeonolwas determ ined by HPLC.RESULTS：The linear range of pae-onol was 0.132-1.188μg/m L（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere less than 3.0%.The recoveries were 100.1%-104.7%（RSD＝2.39%，n＝6）.The analysis spectrum of paeonol was almost completely overlapped w ith the actual spectrum.The results of HPLC method are very sim ilar to those of ATLD algorithm.CONCLUSIONS：The three-dimensional fluorescence coupled w ith ATLD algorithm is simple，rapid，efficient and accurate，and can be used for the qualitative and quantitative analysis of complex system.

Three-dimensional fluorescence；ATLD；Cynanchum paniculatum；Paeonol；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）15-2089-04

2016-06-20

2016-09-21）

（編輯：張 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81173496、20975029）

＊碩士研究生。研究方向：藥物與生物分析化學(xué)。E-mail：550393676@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物與生物分析化學(xué)。E-mail：delongliu9012@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.21