漆立軍，黃華斌，覃鴻恩（湖北恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北恩施 445000）

復(fù)方獨正片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

漆立軍＊，黃華斌，覃鴻恩#（湖北恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北恩施 445000）

目的：建立復(fù)方獨正片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中獨正桿、刺老苞、刺五加、三七進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量：色譜柱為InertsilODS-SP C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0m L/m in，檢測波長為215 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：獨正桿、刺老苞、刺五加、三七的TLC斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.056～0.337μg（r＝0.999 8）、0.022～0.130μg（r＝0.999 9）、0.030～0.182μg（r＝0.999 5）、0.010～0.061μg（r＝0.999 8）、0.038～0.226μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為100.55%～103.80%（RSD＝2.0%，n＝9）、100.00%～104.56%（RSD＝3.0%，n＝9）、97.06%～102.94%（RSD＝2.1%，n＝9）、97.06%～102.94%（RSD＝2.0%，n＝9）、96.67%～100.00%（RSD＝1.5%，n＝9）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于復(fù)方獨正片的質(zhì)量控制。

復(fù)方獨正片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

復(fù)方獨正片源自我院名醫(yī)堂名老中醫(yī)的經(jīng)驗方，是由我院制劑室自主研制的中藥復(fù)方制劑。該方由土家族民族藥獨正桿、刺老苞、刺五加和三七等組成，具有活血化瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨、補益肝腎等功效，主要用于各類軟組織損傷、骨折、風(fēng)濕痹癥及頸肩腰腿疼痛等癥的治療，其作用顯著、療效確切，且在我院相關(guān)?？剖褂脧V泛，作為我院產(chǎn)業(yè)化拳頭產(chǎn)品之一，給醫(yī)院帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)及社會效益[1]。但是，目前尚無準(zhǔn)確控制該制劑內(nèi)在質(zhì)量的方法，亦尚未見其相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究文獻(xiàn)報道[2-4]。因此，筆者擬建立復(fù)方獨正片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為其臨床用藥安全提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC20A型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-20AD四元泵、SPD-M 20A檢測器、SIL-20A進(jìn)樣器（日本Shimadzu公司）；YOKO-2X型紫外線分析儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司）；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500W，頻率：100 kHz）；CPA225D型電子天平（德國Sartorius公司）；HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海寶藍(lán)實驗儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方獨正片（恩施州中心醫(yī)院制劑室自制，批號：2015044、2016004、2016109，規(guī)格：0.5 g/片）；齊墩果酸對照品（批號：110709-201206，純度：94.9%）、紫丁香苷對照品（批號：111574-200603，純度：99.7%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：140806-201509，純度：96.3%）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201424，純度：100%）、三七皂苷R1對照品（批號：140534-201436，純度：98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取樣品細(xì)粉1 g，加甲醇50m L，超聲提取30m in，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1m L使溶解，制成供試品溶液。分別取待測成分對照品適量，加甲醇制成紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1質(zhì)量濃度分別為0.3、0.2、0.2、0.4、0.1mg/m L的混合對照品溶液。按復(fù)方獨正片處方和工藝分別制備缺獨正桿、刺老苞、刺五加、三七的單一陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成單一陰性對照溶液。按薄層色譜法[2015年版《中國藥典》（四部）][5]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5∶4∶2∶3∶0.4，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Inertsil ODS-SPC18（250 nm×4.6 nm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 m in，80%→60%A；15～25 min，60%→40%A；25～30 min，40%→20%A；30～50 m in，20%→10%A）；流速：1.0 m L/m in；檢測波長：215 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果，理論板數(shù)以紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰計均＞3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取待測成分對照品各適量，加甲醇制成紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1質(zhì)量濃度分別為0.028 1、0.010 8、0.015 2、0.005 1、0.018 8mg/m L的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于50m L具塞錐形瓶中，精密加甲醇50m L，精密稱定，超聲提取30m in，取出，冷卻至室溫，精密稱定，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積的RSD分別為0.4%、1.8%、2.1%、0.8%、1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：2016004）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積的RSD分別為2.4%、1.9%、1.3%、1.0%、2.6%（n＝5），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：2016004）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積的RSD分別為0.2%、0.6%、1.9%、0.6%、0.4%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：2016004）0.5 g，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝9）

2.2.9 樣品含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 3 Resultsof contents determ ination of samples（n＝3，mg/tablet）

3 討論

3.1 薄層色譜條件的選擇

筆者考慮到研究對象為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，選用對照藥材分析較為麻煩，且不符合具體指標(biāo)的評價，故選用對照品作為評價指標(biāo)；在綜合處方分析基礎(chǔ)上選擇了紫丁香苷、齊墩果酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1作為指標(biāo)。預(yù)試驗中，筆者分別選用甲醇和乙醇作為供試品溶液制備溶劑進(jìn)行探究，根據(jù)每種待測成分的性質(zhì)和其單一展開系統(tǒng)情況，總結(jié)分析初步擬定5種薄層色譜展開劑系統(tǒng)，分別為環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-水、環(huán)己烷-丙酮-三氯甲烷、環(huán)己烷-丙酮-三氯甲烷-甲醇、環(huán)己烷-丙酮-三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯、丙酮-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸，依次對以上5種系統(tǒng)進(jìn)行不同比例的探索，最終確定丙酮-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5∶4∶2∶3∶0.4，V/V/V/V/V）為展開劑。根據(jù)不同成分的性質(zhì)，綜合顯色條件，分別用稀硫酸溶液和10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑進(jìn)行比較，結(jié)果確定以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑。由于齊墩果酸作為苷元存在，是獨正桿、刺老苞和三七的共同成分，故在單一陰性樣品中也存在齊墩果酸相應(yīng)的斑點。而人參皂苷Rb1顯色不明顯，且含量過低，因此薄層色譜圖中無斑點顯現(xiàn)。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

待測成分中，所分析的對照品均溶于醇，綜合分析，采用正交試驗分別對提取溶劑（甲醇、50%甲醇溶液、乙醇）、提取方法（回流、超聲、浸置）和提取時間（30、45、65 min）進(jìn)行考察，最終得出最佳提取方法為：以甲醇50 m L為溶劑，超聲提取30m in。

3.3 流動相的選擇

預(yù)試驗中，筆者以單一成分進(jìn)行進(jìn)樣分析，紫丁香苷的流動相為甲醇-水[6]，齊墩果酸的流動相為乙腈-水[7]，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的流動相為乙腈-水；后筆者進(jìn)一步分別用甲醇-水和乙腈-水進(jìn)行了對比分析，綜合各種因素并結(jié)合流動相比例最終選定乙腈-水（梯度洗脫）作為流動相系統(tǒng)。

3.4 檢測波長的確定

筆者在190～400 nm波長范圍內(nèi)對供試品溶液進(jìn)行譜圖信息分析，并分別選取203、210、215、225、250、265、280、320 nm波長進(jìn)行對比考察，結(jié)果在210～225 nm波長之間所有待測成分均有明顯吸收，綜合分析最終確定以215 nm作為檢測波長。

3.5 色譜儀和色譜柱的選擇

本試驗選擇了Agilent 1260和Shimadzu LC20A兩種不同品牌的HPLC儀，分別采用InertsilODS-SPC18、Ameritech C18、AccurasilC183種不同色譜柱進(jìn)行分析，以最簡單、有效的保留時間差法進(jìn)行計算。結(jié)果顯示，以Shimadzu LC20A HPLC儀、InertsilODS-SPC18色譜柱進(jìn)行洗脫分析，采用保留時間差法計算可準(zhǔn)確定位目標(biāo)色譜峰。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于復(fù)方獨正片的質(zhì)量控制。

[1] 刁京明，陳龍全，周慶華，等.復(fù)方獨正片治療骨折延遲愈合39例[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報，2005，22（4）：54-56.

[2] 漆立軍.民族藥復(fù)方獨正片的研制及處方分析[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012，19（5）：39-40.

[3] 郝雙階，潘墩，黃瓊.復(fù)方獨正桿接骨湯對肱骨干閉合性骨折愈合過程中IL-1、IL-6、TNF-α的影響[J].中國藥房，2015，26（17）：2378-2380.

[4] 裴凌鵬，尹霞，李莉，等.刺老苞根皮黃酮類化合物對維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松的影響[J].中草藥，2011，42（11）：2279-2282.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

[6] 韓梅，王麗娟，郭雙雙，等.不同種群結(jié)構(gòu)刺五加根和莖中紫丁香苷的含量[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，38（4）：434-438.

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（編輯：張 靜）

Study on Quality Standard of Compound Duzheng Tablets

Q I Lijun，HUANG Huabin，Q IN Hong’en（Dept.of Pharmacy，Hubei Enshi Tujia and M iao Autonomous Prefecture Centeral Hospital，Hubei Enshi445000，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Compound duzheng tablets.METHODS：TLC method was used for qualitative identification of Vitis davidii，Aralia chinensis，Acanthopanax senticosus and Panax notoginseng in the preparation.The contents of syringoside，oleanolic acid，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and notoginsenoside R1were determined by HPLC.The determ ination was performed on Inertsil ODS-SP C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 m L/m in.The detection wavelength was set at 215 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10μL.RESULTS：TLC spots of V.davidii，A.chinensis，A.senticosus and P.notoginseng were clear and well-separated w ithout interference from negative control.The linear ranges of syringoside，oleanolic acid，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and notoginsenoside R1were 0.056-0.337μg（r＝0.999 8），0.022-0.130μg（r＝0.999 9），0.030-0.182μg（r＝0.999 5），0.010-0.061μg（r＝0.999 8），0.038-0.226μg（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 3.0%.The recoverieswere 100.55%-103.80%（RSD＝2.0%，n＝9），100.00%-104.56%（RSD＝3.0%，n＝9），97.06%-102.94%（RSD＝2.1%，n＝9）、97.06%-102.94%（RSD＝2.0%，n＝9），96.67%-100.00%（RSD＝1.5%，n＝9）.CONCLUSIONS：Established standard can be used for the quality controlof Compound duzheng tablets.

Compound duzheng tablets；Quality standard；TLC；HPLC

R927

A

1001-0408（2017）15-2124-04

2017-02-10

2017-03-22）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院制劑。E-mail：58659685@qq.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥制劑現(xiàn)代化。E-mail：1137511834@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.30