劉志霞 王興奎 張艷萍

(河北省唐山車(chē)城醫(yī)院內(nèi)二科，河北 唐山 064000)

芪參龜散對(duì)Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉志霞 王興奎 張艷萍1

(河北省唐山車(chē)城醫(yī)院內(nèi)二科，河北 唐山 064000)

目的 觀察芪參龜散對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。方法 提取Wistar大鼠小腸內(nèi)表面黏膜的α-葡萄糖苷酶后行酶活力測(cè)定，確定最佳反應(yīng)體系，將芪參龜散用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，過(guò)濾，并稀釋成不同濃度的溶液，再將同濃度的芪參龜散脫色，并稀釋成不同濃度的溶液，同時(shí)以阿卡波糖片作為對(duì)照藥物，觀察芪參龜散對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果 芪參龜散有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制作用。結(jié)論 芪參龜散與阿卡波糖片有相似的降糖作用。

α葡糖苷酶類(lèi)；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)；中藥

隨著人們生活水平的不斷提高，2型糖尿病患病率越來(lái)越高，研發(fā)治療2型糖尿病的藥物也越來(lái)越多，尤其是控制餐后高血糖的藥物研發(fā)已成為一個(gè)熱點(diǎn)[1]。臨床中α-葡萄糖苷酶抑制劑藥效確切，已成為治療2型糖尿病的一線藥物。但目前α-葡萄糖苷酶抑制劑臨床中應(yīng)用的藥物種類(lèi)較少，且有腹瀉、腹脹、排氣增加等副作用，部分患者不能耐受。為尋找高效、副作用少的α-葡萄糖苷酶抑制劑，我們從中藥復(fù)方入手，尋找有效抑制α-葡萄糖苷酶的新藥，本研究觀察芪參龜散對(duì)Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠2只，無(wú)特定病原體級(jí)(SPF級(jí))，雄性，體質(zhì)量平均(250±10) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK京2009-0004，飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學(xué)10 000級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用證明編號(hào)：MY10DXK07，室溫20 ℃，相對(duì)濕度45%左右，自由飲水，每日光照12 h。

1.1.2 藥品及試劑 阿卡波糖片(杭州中美華東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020202)，芪參龜散(藥物組成：炙黃芪50 g，丹參30 g，龜版15 g，山藥30 g，女貞子15 g，墨旱蓮15 g，白術(shù)20 g，陳皮10 g，太子參20 g，金銀花20 g。以上10味藥混勻，用中藥粉碎機(jī)粉碎成粉，過(guò)孔徑為0.1 mm藥篩后所得細(xì)粉備用)，麥芽糖(分析純，汕頭市光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)051210)，活性炭粉(分析純，pH值5.0～7.0)，血糖測(cè)定試劑盒(上海科華東菱診斷用品有限公司)，0.9%氯化鈉注射液，磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.1.3 儀器 高速低溫離心機(jī)(型號(hào)：X-22R，德國(guó)BECKMAN公司)，酶標(biāo)儀(型號(hào)：BIO-RAD，上海甘薇生物科技有限公司)、Sartorius電子分析天平(型號(hào)：BS224S，德國(guó)賽多利斯集團(tuán))。

1.2 方法及步驟

1.2.1 α-葡萄糖苷酶液的提取[1]Wistar大鼠2只，在禁食24 h后經(jīng)脫臼處死，剖腹后取小腸約20 cm，輕輕擠壓排出內(nèi)容物，在冰板上剪開(kāi)小腸，刮取其內(nèi)表面黏膜，之后加入2倍量4 ℃的pH 值為6.8的PBS緩沖液，用玻璃勻漿器在冰板上勻漿，于4 ℃、5 000 r/min離心機(jī)離心20 min，取上清液即為α-葡萄糖苷酶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活性檢測(cè)及最佳反應(yīng)體系的確定

1.2.2.1 酶活性檢測(cè)[2]反應(yīng)容積確定為1 mL，取α-葡萄糖苷酶液0.05 mL，加入pH值為6.8的PBS緩沖液0.4 mL中，在溫度為37 ℃條件下水浴10 min，加入濃度為0.25 mol/L的麥芽糖溶液0.05 mL中，反應(yīng)30 min后再加入濃度為0.1 mol/L的碳酸鈉(Na2CO3)溶液0.5 mL終止反應(yīng)。氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量。在37 ℃、pH值為6.8的條件下，每min水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量,規(guī)定為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2.2 最佳反應(yīng)體系的確定 酶濃度的確定：取濃度為0.25 mol/L的麥芽糖溶液0.05 mL，加入稀釋不同倍數(shù)(2、4、8倍)的α-葡萄糖苷酶液0.05 mL中，在溫度為37 ℃條件下反應(yīng)20 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，依據(jù)葡萄糖的生成量計(jì)算α-葡萄糖苷酶活力。酶反應(yīng)底物的確定：在1 mL反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0.125、0.25、0.5 mol/L的麥芽糖溶液，從加入麥芽糖開(kāi)始反應(yīng)起,在37 ℃恒溫箱中反應(yīng)，分別于10、20、30 min后，檢測(cè)葡萄糖含量,于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,根據(jù)葡萄糖的生成量計(jì)算α-葡萄糖苷酶活力。

1.3 芪參龜散溶液脫色試驗(yàn)[3]

1.3.1 脫色時(shí)間的確定 稱取芪參龜散2.5 g放入1 000 mL燒杯中，加PBS緩沖液至500 mL，再放入沸水鍋中煮10 min，蒸發(fā)的水分用同時(shí)間煮的PBS緩沖液補(bǔ)齊，然后將藥液抽濾，得到5 mg/mL的溶液放入標(biāo)準(zhǔn)瓶中，晾涼備用。取100 mL配好的溶液放入200 mL燒杯中，然后稱取0.5 g活性炭放入燒杯中，攪勻，再放入沸水鍋中煮10 min，補(bǔ)齊容量，攪勻，留取樣品4 mL放入試管中，同法留取15、20、30、40、60 min樣品放入試管中備用。6個(gè)試管同時(shí)離心4 000 r/min，10 min，然后取上清液，用721型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度值。

1.3.2 活性炭用量的確定 取0.5 g芪參龜散加PBS緩沖液至100 mL，攪勻，在沸水鍋中煮10 min，取出后用同時(shí)間煮的PBS緩沖液補(bǔ)齊容量，然后過(guò)濾，得到5 mg/mL的溶液,晾涼備用。稱取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g活性炭分別放入6個(gè)燒杯中，然后依次在每個(gè)燒杯中加入10 mL配好的濃度為5 mg/mL的芪參龜散溶液，攪勻，然后放入沸水鍋中煮，20 min后取出，補(bǔ)齊容量，攪勻，留取4 mL藥液備用。然后再煮10 min，補(bǔ)齊容量，攪勻，留取4 mL備用。最后將6個(gè)不同活性炭濃度的12個(gè)樣本，同時(shí)離心，取上清液，用721型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度值。

1.4 芪參龜散溶液及阿卡波糖溶液的制備 稱取芪參龜散及阿卡波糖片各4 mg，分別加入PBS緩沖液8 mL，過(guò)濾，分別稀釋成5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1mg/mL濃度的溶液，分裝于EP管中，-20 ℃冷凍保存，備用。稱取芪參龜散0.5 g加PBS緩沖液至100 mL，得到5 mg/mL溶液，加0.03 g活性炭，脫色20 min后晾涼，留取5 mg/mL濃度的芪參龜散溶液4 mL裝于EP管中，并將芪參龜散溶液稀釋成5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1mg/mL濃度的溶液，分裝于EP管中，-20 ℃冷凍保存，備用。

1.5 芪參龜散對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的檢測(cè) 首先上述各種溶液各取0.1 mL，加0.3 mL PBS緩沖液，再加入0.05 mL 4倍稀釋的α-葡萄糖苷酶液；設(shè)對(duì)照組只加0.4 mLPBS緩沖液，再加0.05 mL 4倍稀釋的α-葡萄糖苷酶液酶液；設(shè)空白組只加0.5 mL PBS緩沖液，在37 ℃恒溫箱中反應(yīng)10 min。除空白組不加麥芽糖溶液外，其余各組均加入0.05 mL濃度為0.25 mol/L麥芽糖溶液，于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)20 min，再加入0.5 mL濃度為0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，空白組不加Na2CO3溶液。在96孔板孔中加入各反應(yīng)液0.02 mL，再加入0.2 mL等比例稀釋的酚酶試劑，每個(gè)濃度做6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，在37 ℃恒溫箱中反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下反應(yīng)液的吸光度值。抑制率(%)=(對(duì)照組反應(yīng)液吸光度值-樣品反應(yīng)液吸光度值)/(對(duì)照組反應(yīng)液吸光度值-空白組反應(yīng)液吸光度值)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)反應(yīng)體系的吸光度值計(jì)算受試物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，吸光度值用6個(gè)復(fù)孔的均數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 最佳反應(yīng)體系 首先取0.1 mL待測(cè)溶液，加入0.3 mL pH 值為6.8的PBS緩沖液，然后加入0.05 mL 4倍稀釋的α-葡萄糖苷酶液,在37 ℃恒溫箱中反應(yīng)10 min，再加入0.05 mL濃度為0.25 mol/L的麥芽糖溶液作為底物，在37 ℃反應(yīng)條件下反應(yīng)20 min后加入0.5 mLNa2CO3溶液終止反應(yīng)為最佳反應(yīng)體系。

2.2 最佳脫色條件 稱取芪參龜散0.5 g，加PBS緩沖液至100 mL，得到5 mg/mL溶液，加0.03 g活性炭，脫色20 min為最佳脫色條件。

2.3 芪參龜散對(duì)體外α-葡萄糖苷酶活力的影響 通過(guò)芪參龜散對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究表明，芪參龜散有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度芪參龜散脫色前后及阿卡波糖片α-葡萄糖苷酶抑制率比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，2型糖尿病屬消渴范疇，病變臟腑主要責(zé)之肺、脾、腎[4]三臟，病機(jī)為肺燥胃熱，脾腎虧虛，日久多以氣陰兩傷、脈絡(luò)瘀阻為主要病機(jī)[4]。基于消渴的病變臟腑及發(fā)病機(jī)制，組方芪參龜散，由炙黃芪、丹參、龜版、山藥、女貞子、墨旱蓮、白術(shù)、陳皮、太子參、金銀花10味中藥組成，其中炙黃芪為君，補(bǔ)脾益氣；丹參活血通經(jīng)，祛瘀止痛，龜版、山藥滋腎陰，健脾胃，均為臣；炒白術(shù)、陳皮、太子參、女貞子、墨旱蓮增強(qiáng)益氣健脾補(bǔ)腎之效，金銀花清熱解毒，清宣肺熱，均為佐。全方補(bǔ)瀉兼施，益氣活血，補(bǔ)脾益腎，兼清肺熱，起到清上補(bǔ)下的作用。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有保護(hù)心、腦、肝、腎、肺的作用，還有降脂、降糖、減少糖尿病并發(fā)癥等作用[5]。丹參對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)均有作用，還有抗凝、抗菌消炎、抗氧化作用[6]。龜版有效成分有抗表皮干細(xì)胞凋亡的作用[7-8]。女貞子有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老的作用[9]。墨旱蓮水提物能降低大鼠高同型半胱氨酸血癥，調(diào)血脂，保護(hù)血管內(nèi)膜[10]，同時(shí)對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[11]，改善老年癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能[12]，具有抗衰老作用[13]；墨旱蓮總黃酮具有清除活性氧自由基作用，可抑制卵磷脂脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷[14]。山藥具有降糖、降脂、抗氧化、抗腫瘤的藥理活性[15]，還可促進(jìn)腎臟再生修復(fù)，延緩衰老[16]。陳皮有明顯的肝臟保護(hù)和腫瘤抑制作用，還有呼吸系統(tǒng)疾病的防治作用，亦有抗炎、抗氧化、降脂作用[17]。太子參可保護(hù)心肌，增強(qiáng)免疫，抗應(yīng)激，抗氧化，治療糖尿病[18]。金銀花具有消炎、抑菌、抗病毒、止血、養(yǎng)肝護(hù)膽的藥理作用[19]。芪參龜散通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用，達(dá)到控制糖尿病目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪參龜散有α-葡萄糖苷酶抑制作用，芪參龜散低、中劑量組α-葡萄糖苷酶抑制率隨藥物濃度的增加而升高，高劑量組α-葡萄糖苷酶抑制率隨藥物濃度的增加而降低，主要責(zé)之于高劑量組藥物溶液顏色較深。高劑量組藥物溶液經(jīng)活性炭脫色后其抑制率有所升高，但應(yīng)用活性炭脫色后芪參龜散的整體抑制率降低，考慮活性炭在脫色的同時(shí)也將中藥中的一部分有效成分脫走，影響了α-葡萄糖苷酶抑制率的檢測(cè)結(jié)果。

中藥復(fù)方一般顏色偏深，而顏色深直接影響吸光度值的測(cè)定，進(jìn)而影響到α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定結(jié)果。為減少顏色對(duì)抑制率的影響，脫色試驗(yàn)尤為必要。芪參龜散溶液應(yīng)用活性炭脫色時(shí)，脫色20 min和30 min吸光度值均偏小，脫色效果較好；且肉眼觀察20 min的脫色液略帶黃色，30 min脫色液接近無(wú)色?？紤]40、60 min隨脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，雖顏色更淺，但藥物有效成分也被活性炭吸收得更多，因此選20、30 min 2個(gè)時(shí)間作為下一步脫色時(shí)間。吸光度值越小，脫色效果越好。但也要考慮脫色后溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果。若脫色后藥液仍有α-葡萄糖苷酶抑制作用，則達(dá)到脫色目的。后經(jīng)α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)證明，芪參龜散溶液脫色30 min后抑制率較20 min明顯降低，選定20 min為最佳脫色時(shí)間；應(yīng)用0.03 g活性炭脫色效果較好，且有α-葡萄糖苷酶抑制作用。最終確定5 mg/mL濃度的芪參龜散溶液10 mL，加0.03 g活性炭，脫色20 min為最佳脫色條件。脫色過(guò)程中應(yīng)注意，在抽濾時(shí)溶液中不要有沉淀，否則會(huì)直接影響活性炭的脫色效果和用量。

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(本文編輯：習(xí) 沙)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.06.020

R349.29；R446；R698.2；R-331

A

1002-2619(2017)06-0884-04

劉志霞(1977—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中藥治療2型糖尿病、腦血管病臨床研究工作。

2016-12-07)

1 河北省遷安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，河北 遷安 064000