李猛剛，閆云君

(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430074)

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防御假單胞菌Pf-5中Rsm調(diào)控系統(tǒng)對脂肪酶表達(dá)的影響

李猛剛，閆云君

(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430074)

Rsm系統(tǒng)在細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。以防御假單胞菌Pf-5為研究對象，將其中的rsmY、rsmZ基因敲除，構(gòu)建rsmY、rsmZ單突變株和rsmY/rsmZ雙突變株，然后分析野生菌和突變株中l(wèi)ipA的全細(xì)胞脂肪酶相對活性及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活。結(jié)果表明，rsmY、rsmZ主要在轉(zhuǎn)錄后水平影響lipA的表達(dá)；rsmY、rsmZ均抑制rsmA和rsmE的表達(dá)，在rsmY、rsmZ敲除后，rsmA的表達(dá)水平有所提高，而rsmE的表達(dá)水平則顯著提高。因此，rsmY、rsmZ對rsmE的影響要明顯高于對rsmA的影響，其主要是通過影響rsmE的表達(dá)從而調(diào)控Pf-5中l(wèi)ipA的表達(dá)。

基因表達(dá)調(diào)控；脂肪酶；假單胞菌；Rsm；基因敲除；小分子RNA

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一段基因間區(qū)域，此區(qū)間段的基因無法翻譯或是編碼成蛋白質(zhì)，基因序列缺乏開放閱讀框，在原核細(xì)胞中通常稱為sRNA(small RNA)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，細(xì)菌中一些調(diào)控因子在調(diào)控基因表達(dá)的時候需要sRNA(例如RsmX、RsmY、RsmZ)的調(diào)節(jié)和參與。這些sRNA與蛋白競爭性地和RsmA結(jié)合從而調(diào)控基因表達(dá)。RsmA是假單胞菌屬中高度保守的全局性調(diào)控因子，在熒光假單胞菌P.fluorescensCHA0中，它是一個負(fù)調(diào)控因子，能與RNA分子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平控制著受GacA/GacS系統(tǒng)調(diào)節(jié)的次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)。RsmA主要通過與調(diào)控基因的mRNA結(jié)合來抑制調(diào)控基因的表達(dá)[6]，而這種結(jié)合會被rsmX/Y/Z與RsmA的結(jié)合所阻止[2,7]。在防御假單胞菌P.protegensPf-5中存在著rsmX、rsmY、rsmZ、rsmA、rsmE等非編碼RNA，它們在細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[8]，一起構(gòu)成了P.protegensPf-5中的Rsm系統(tǒng)。為進(jìn)一步了解P.protegensPf-5中調(diào)控脂肪酶lipA表達(dá)的分子機(jī)理，本文通過基因敲除、全細(xì)胞脂肪酶相對活性的測定以及qRT-PCR等方法重點研究了Rsm系統(tǒng)與lipA表達(dá)的關(guān)系。

1 實驗

1.1 材料及試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

防御假單胞菌P.protegensPf-5，野生菌株，本實驗室保存。Pf6285，rsmZ突變菌株；PfΔrsmY，rsmY突變菌株；PfΔrsmYΔrsmZ，rsmY和rsmZ雙突變菌株。突變菌株均由本研究所構(gòu)建。

pRK2073，三親雜交輔助質(zhì)粒；pJQ200SK，敲除用質(zhì)粒;穿梭質(zhì)粒pBBRM1CS-5，過表達(dá)用質(zhì)粒。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用LB培養(yǎng)基(包括液態(tài)和固態(tài))。配制培養(yǎng)基的蛋白胨、酵母提取物以及瓊脂糖購自O(shè)xoid公司。培養(yǎng)基中抗生素使用濃度：氨芐青霉素，100μg/mL；慶大霉素，50μg/mL；卡那霉素，50μg/mL；大觀霉素，100μg/mL。

1.1.3 試劑

實驗中所用的各種酶，包括限制性內(nèi)切酶、Taq酶等都購自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒以及細(xì)菌總DNA提取試劑盒購自O(shè)megaBio-Tek公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoFisherScientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 rsmY及rsmZ基因敲除

利用二次同源重組的辦法，以蔗糖作為負(fù)篩選標(biāo)記，采用敲除質(zhì)粒pJQ200SK進(jìn)行無痕敲除，只將整個目標(biāo)基因序列敲除，而不影響其他基因序列。首先采用融合PCR手段將rsmY上下游序列整合在一起，然后將缺失rsmY序列的ΔrsmY序列與pJQ200SK載體連接，通過三親雜交方式轉(zhuǎn)入野生型Pf-5，ΔrsmY序列通過同源重組的方法將野生型的rsmY序列置換，就構(gòu)建成了ΔrsmY突變菌株(命名為PfΔrsmY)。用同樣方法構(gòu)建rsmZ突變菌株(命名為Pf6285)和rsmY/rsmZ雙突變菌株(命名為PfΔrsmYΔrsmZ)。

1.2.2 菌株生長曲線的制作

分別取野生菌株P(guān)f-5和上述3種突變菌株在5mL的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、200r/min培養(yǎng)16h，然后測其OD600值。將各菌液的OD600值調(diào)為一致，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200r/min培養(yǎng)，每隔2h取樣，測OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、菌液OD600值為縱坐標(biāo)做生長曲線。

1.2.3 lacZ融合報告菌株的構(gòu)建

lacZ融合載體的構(gòu)建方法為：①以Pf-5基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增lipA′-P(+6bp到+891bp)；②將擴(kuò)增的lipA′-P片段用KpnI-HindIII進(jìn)行雙酶切,然后與′lacZ(+22bp到+3110bp)片段進(jìn)行酶連；③將lipA′-P與′lacZ連接成功的片段以及載體pJQ200SK進(jìn)行SphI-BamHI雙酶切后連接；④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10后涂抗性平板；⑤通過菌落PCR鑒定陽性克隆子；⑥提取陽性克隆子的質(zhì)粒并測序。將測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pJQ003，也就是lipA′-′lacZ融合質(zhì)粒。

采用同樣的方法構(gòu)建lipA-lacZ(lipA的序列為-16bp到+891bp，lacZ序列為-10bp到+3110bp)融合質(zhì)粒pJQ004、rsmA′-′lacZ融合質(zhì)粒pJQ005(rsmA′的序列為+6bp到+189bp)和rsmE′-′lacZ融合質(zhì)粒pJQ006(rsmE′的序列為+6bp到+195bp)。通過三親雜交將pJQ003、pJQ004、pJQ005和pJQ006分別導(dǎo)入到Pf-5以及Pf6285、PfΔrsmY、PfΔrsmYΔrsmZ中構(gòu)建染色體整合型lipA′-′lacZ翻譯融合報告菌株、lipA-lacZ轉(zhuǎn)錄融合報告菌株、rsmA′-′lacZ翻譯融合報告菌株和rsmE′-′lacZ翻譯融合報告菌株。

1.2.4 lipA的qRT-PCR

qRT-PCR實驗步驟如下：①將野生菌Pf-5和3種突變菌株分別接種于50mL的LB培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)至OD600約為5.7；②用RNApureBacteriaKit(DNaseI)試劑盒抽提總RNA；③對RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測及定量；④根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明合成cDNA；⑤利用rpoD作為內(nèi)參基因，分析lipA在不同突變株中的表達(dá)差異。

1.2.5 全細(xì)胞脂肪酶及β-半乳糖苷酶酶活測定

①將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃或37 ℃培養(yǎng)12 h；②4 ℃、5000 r/min離心10 min收集菌體，用5 mL0.9%NaCl溶液重懸菌體，重復(fù)該步操作2次；③再用5 mL0.9%NaCl溶液重懸菌體，即得全細(xì)胞。全細(xì)胞脂肪酶酶活測定采用pNP法[9]，β-半乳糖苷酶酶活測定參照Miller法[10]。

2 實驗結(jié)果

2.1rsmY及rsmZ敲除結(jié)果

采用無痕敲除的辦法將目標(biāo)基因序列完全敲除，同時不引入外源基因序列，通過蔗糖負(fù)篩選標(biāo)記對突變株進(jìn)行篩選，效果較好，如圖1所示。

1,2：rsmZ突變株；3：野生菌株；M：DNA marker

(a)rsmZ敲除

M：DNA marker；1：野生菌株；2：rsmY突變株

Fig.1ElectrophoretogramsofPCRproductsaftertheknock-out ofrsmZandrsmY

2.2rsmY及rsmZ敲除對細(xì)菌生長的影響

圖2為野生菌株和突變菌株的生長曲線。從圖2可以看出，rsmY、rsmZ單突變菌株的生長曲線和野生菌株的基本一致，而rsmY/rsmZ雙突變后，細(xì)菌的生長曲線與野生菌株的相差較大。雙突變菌株的生長速率變慢，穩(wěn)定期后的OD600值也明顯下降，表明rsmY及rsmZ雙突變會影響細(xì)菌的生長，而rsmY和rsmZ相互之間可能存在互補(bǔ)的作用，因此，單突變?nèi)我换驅(qū)?xì)菌的生長并未造成影響。

圖2 野生菌株和突變菌株的生長曲線

2.3rsmY及rsmZ敲除對Pf-5lipA表達(dá)的影響

為研究rsmY、rsmZ對lipA表達(dá)的影響，分別測定了rsmY和rsmZ單敲除以及雙敲除后全細(xì)胞脂肪酶的相對活性，結(jié)果見圖3。

圖3 野生菌株和突變株中全細(xì)胞脂肪酶的相對酶活

Fig.3 Relative enzyme activity of whole cell lipase in the wild and mutant strains

從圖3中可以看出，與野生菌株相比，不管是rsmY還是rsmZ單敲除，lipA的全細(xì)胞脂肪酶活性均有所下降；將兩個基因同時敲除后，lipA的全細(xì)胞脂肪酶活性急劇下降，其相對酶活只有野生菌株的17%左右。這是因為將rsmY和rsmZ敲除后，對細(xì)菌脂肪酶lipA表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)疊加，導(dǎo)致lipA的活性顯著降低。這個結(jié)果也說明rsmY和rsmZ能夠調(diào)控lipA的表達(dá)。

為了分析rsmY以及rsmZ是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平影響lipA的表達(dá)，分別構(gòu)建了染色體整合型lipA-lacZ和lipA′-′lacZ的報告菌株，并分別測定了穩(wěn)定期的野生型和突變株的β-半乳糖苷酶的酶活，結(jié)果見圖4和圖5。由圖可見，不管是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平，rsmY及rsmZ的敲除都會影響lipA的表達(dá)，但是在翻譯水平的影響更加明顯。

Pf-5F4：野生菌株融合lipA-lacZ； Pf6285F4：rsmZ突變株融合lipA-lacZ； PfΔrsmYF4：rsmY突變株融合lipA-lacZ； PfΔrsmYΔrsmZF4：rsmY/rsmZ雙突變株融合lipA-lacZ

圖4 染色體整合型lipA-lacZ轉(zhuǎn)錄融合報告菌株的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.4β-galactosidaseactivityofchromosome-bornelipA-lacZtranscriptionalfusionreportstrains

Pf-5F3：野生菌株融合lipA′-′lacZ；Pf6285F3：rsmZ突變株融合lipA′-′lacZ；PfΔrsmYF3：rsmY突變株融合lipA′-′lacZ； PfΔrsmYΔrsmZF3：rsmY/rsmZ雙突變株融合lipA′-′lacZ

圖5 染色體整合型lipA′-′lacZ翻譯融合報告菌株的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.5 β-galactosidase activity of chromosome-bornelipA′-′lacZtranslationalfusionreportstrains

為了進(jìn)一步驗證lacZ融合的結(jié)果，利用qRT-PCR來進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，rsmY及rsmZ的敲除會影響lipA的表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄水平上的mRNA含量并沒有急劇降低，這也說明了rsmY及rsmZ主要是在翻譯水平影響lipA的表達(dá)。

2.4 rsmY及rsmZ敲除對rsmA、rsmE的影響

本課題組前期研究[11]表明，在Pf-5中，是rsmE而不是rsmA與lipA的啟動子序列直接結(jié)合來調(diào)控lipA的表達(dá)；文獻(xiàn)[12]亦報道，在熒光假單胞菌CHA0中，rsmX/Y/Z能夠與RsmA及RsmE結(jié)合，阻斷RsmA、RsmE與調(diào)控基因的mRNA結(jié)合，從而能夠調(diào)控基因表達(dá)。因此下面進(jìn)一步分析在Pf-5中rsmY、rsmZ主要是通過rsmA還是rsmE來調(diào)控lipA的表達(dá)。

圖6lipA在野生菌株和突變株中表達(dá)的qRT-PCR分析

Fig.6 qRT-PCR analysis oflipAexpression in the wild and mutant strains

染色體整合型rsmA′-′lacZ和rsmE′-′lacZ在野生菌株和突變菌株中的β-半乳糖苷酶酶活如圖7所示。由圖7可見，rsmY、rsmZ單敲除對rsmA和rsmE的表達(dá)影響均比較小，而雙敲除后，rsmA、rsmE的表達(dá)均有所提高，并且在對數(shù)生長后期以及穩(wěn)定期，雙敲除突變株的rsmE表達(dá)急劇增加。

(a)rsmA′-′lacZ

(b)rsmE′-′lacZ

圖7rsmA′-′lacZ及rsmE′-′lacZ在野生菌株和突變菌株中的β-半乳糖苷酶酶活

Fig.7 β-galactosidase activity ofrsmA′-′lacZandrsmE′-′lacZinthewildandmutantstrains

3 討論

Rsm調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。在P.protegensCHA0中，RsmE和RsmA能與rsmX/Y/Z的GGA區(qū)域結(jié)合，從而阻斷RsmA、RsmE與調(diào)控基因的mRNA結(jié)合[7]。因此，在Rsm調(diào)控系統(tǒng)中，rsmX/Y/Z是與RsmA以及RsmE協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用的。而在P.protegensPf-5中也包含RsmA和RsmE，而且RsmE與lipA的啟動子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控lipA的表達(dá)[11]，因此，有必要深入研究rsmY、rsmZ影響lipA表達(dá)的分子機(jī)理。

本研究通過將rsmY、rsmZ基因敲除，并分析lipA的全細(xì)胞脂肪酶活性以及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活，發(fā)現(xiàn)rsmY、rsmZ主要在轉(zhuǎn)錄后水平影響lipA的表達(dá)。另外，rsmY、rsmZ均抑制rsmA、rsmE的表達(dá)。rsmY、rsmZ敲除后，rsmA、rsmE的表達(dá)水平均提高，而rsmE的表達(dá)則是顯著提高，這些結(jié)果表明rsmY和rsmZ對rsmE的影響要明顯高于其對rsmA的影響。結(jié)合前期研究結(jié)果可以推測，rsmY、rsmZ主要是通過影響rsmE的表達(dá)來調(diào)控lipA的表達(dá)。而在Pf-5的近緣菌株P(guān).protegensCHA0中，rsmA、rsmE均可以與rsmY、rsmZ結(jié)合，但rsmA的表達(dá)強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于rsmE的表達(dá)強(qiáng)度，而且rsmA的表達(dá)從對數(shù)生長期開始一直持續(xù)至穩(wěn)定期，而rsmE的表達(dá)則是從對數(shù)生長后期開始直至穩(wěn)定期。

另外，在Pf-5中，rsmE的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)差異性高于rsmA，這也可能是rsmY/Z選擇通過rsmYZ/RsmE/LipA途徑激活lipA翻譯而不選擇通過rsmYZ/RsmA/RsmE/LipA途徑來抑制lipA翻譯的原因。結(jié)合已有的研究結(jié)果可以進(jìn)一步證實rsmY、rsmZ與rsmA、rsmE的相互關(guān)系，更加明確Rsm調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)理。

4 結(jié)語

本文通過rsmY、rsmZ基因敲除構(gòu)建防御假單胞菌Pf-5的突變株，分析野生菌株和突變株中l(wèi)ipA的全細(xì)胞脂肪酶活性及染色體整合型lipA-lacZ、lipA′-′lacZ、rsmA′-′lacZ、rsmE′-′lacZ的β-半乳糖苷酶酶活，并采用qRT-PCR等分析手段，首次證明了在Pf-5中，rsmY、rsmZ在翻譯水平抑制rsmA和rsmE的表達(dá)，而且主要是通過抑制rsmE的翻譯來激活lipA翻譯，從而調(diào)控lipA的表達(dá)。這些結(jié)果可為進(jìn)一步研究脂肪酶lipA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制、構(gòu)建脂肪酶高效表達(dá)的基因工程菌提供新的思路和方法。

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[責(zé)任編輯 尚 晶]

Effect of Rsm regulatory system on the expression of lipase inPseudomonasprotegensPf-5

LiMenggang,YanYunjun

(College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China)

Rsm system is a very important expression regulation factor for bacterial genes. This study focused onPseudomonasprotegensPf-5. Through the knockout ofrsmYandrsmZgenes, thersmYmutant,rsmZmutant andrsmY/rsmZdouble mutant were constructed. The relative whole-cell lipase activities oflipAand β-galactosidase activities of chromosome-bornelipA-lacZ,lipA′-′lacZ,rsmA′-′lacZandrsmE′-′lacZfusions in the wild and mutant strains were analyzed. The results show thatrsmYandrsmZmainly affect the expression oflipAat the post-transcriptional level. Moreover, bothrsmYandrsmZinhibit the expression ofrsmAandrsmE, and the knockout ofrsmYandrsmZcan slightly improve the expression level ofrsmAand significantly enhance that ofrsmE. In conclusion,rsmYandrsmZhave greater influence onrsmEthan onrsmA, and they regulate the expression oflipAin Pf-5 mainly through affecting the expression ofrsmE.

gene expression regulation; lipase;Pseudomonas; Rsm; gene knockout; small RNA

2017-04-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(31070078)；湖北省自然科學(xué)基金重點項目(2015CFA085).

李猛剛(1982-)，男，華中科技大學(xué)博士生. E-mail:menggang2004@163.com

閆云君(1969-)，男，華中科技大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師. E-mail:yyyunjun@163.com

10.3969/j.issn.1674-3644.2017.04.007

Q784

A

1674-3644(2017)04-0274-05