李慧，張彥麗，崔曉燕，劉琳，劉云

(1.河北省石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北石家莊050031；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011)

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀細(xì)菌內(nèi)毒素含量

李慧1，張彥麗1，崔曉燕2，劉琳1，劉云1

(1.河北省石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北石家莊050031；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011)

目的建立測(cè)定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。方法按照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》，采用動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，測(cè)定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。結(jié)果當(dāng)供試品稀釋質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，無干擾作用，細(xì)菌內(nèi)毒素回收率為50%～200%。結(jié)論動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素，細(xì)菌內(nèi)毒素含量均遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的0.25 EU/mg，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)可作進(jìn)一步提高。

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀；細(xì)菌內(nèi)毒素；動(dòng)態(tài)濁度法

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀是阿莫西林鈉和克拉維酸鉀的復(fù)方制劑，是臨床應(yīng)用廣泛的抗菌藥物[1]，對(duì)β－內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌所致下呼吸道感染均具有有效的抑制作用[2]，可用于治療多種感染性疾病。目前，阿莫西林鈉克拉維酸鉀復(fù)合制劑的應(yīng)用越來越普及，甚至超過了單用阿莫西林[3]。另外，其為靜脈滴注，為了保障患者的用藥安全，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素控制有實(shí)際意義。細(xì)菌內(nèi)毒素最常用的檢查法一般是鱟試劑試驗(yàn)法[4]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)用凝膠法進(jìn)行檢查，為限量檢查法，不能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法[5－6]以凝膠試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中內(nèi)毒素含量進(jìn)行定量測(cè)定[7－9]。參照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》[10]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的動(dòng)態(tài)濁度法，以建立更靈敏、準(zhǔn)確的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

64 well Kinetic Tube Reader光度試管儀（英國(guó)萊伯金耐特有限公司），TM－1FN型自動(dòng)漩渦混合器（日本三洋公司）。

1.2 試藥

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為150601－201580，規(guī)格為每支80 U）；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(批號(hào)為1505080，規(guī)格為1.25 m L，檢測(cè)范圍為10～0.03 EU/m L）；鱟試劑（批號(hào)為1505080，規(guī)格為0.1m L，靈敏度為0.25 EU/m L）；BET用水（批號(hào)為1503250，規(guī)格為5m L），均由湛江安度斯生物有限公司提供。注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀（H生產(chǎn)企業(yè)，批號(hào)分別為078160551，078160552，078160553）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

按照2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，L＝K/M，其中K為人用每1 kg體質(zhì)量每1 h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，K＝5 EU/(kg·h）；M為人用每1 kg體質(zhì)量每1 h最大供試品劑量，根據(jù)說明書，每1 h內(nèi)可能的最大給藥劑量為1.2 g，人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，L定為0.25 EU/mg為宜，與藥典規(guī)定一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和可靠性分析

取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品1支，用BET用水溶解并進(jìn)行稀釋，使其最終濃度分別為2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/m L，分別取0.1mL加至預(yù)先加有0.1m L動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入動(dòng)態(tài)試管儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，其中每一濃度平行加3管，同時(shí)用BET用水作為陰性對(duì)照。以平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)（lg T）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值（lgC）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為lg T＝2.811 7－0.241 1 lgC，相關(guān)系數(shù)(r)＝－0.9952(絕對(duì)值應(yīng)＞0.980)。平行管之間的變異系數(shù)均小于2%，陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3 干擾試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)為078160551，規(guī)格為1.2 g)，加BET用水10 mL溶解，制成質(zhì)量濃度為120 g/L的溶液，將其稀釋2，10，20，50倍備用（A液）；制備含0.5 EU/m L（λm）內(nèi)毒素的不同稀釋倍數(shù)的供試品溶液（B液）；同時(shí)制備0.031 25，0.125，0.5，2.0 EU/mL內(nèi)毒素溶液（C液）；陰性對(duì)照管為BET用水（D液）。分別取上述溶液各0.1 m L加入預(yù)先加有0.1m L試劑的反應(yīng)管中，每一濃度平行加2管，混勻，立即置Kinetic Tube Reader光度試管儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線與可靠性分析結(jié)果

表2 供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果

表4 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

供試品在稀釋質(zhì)量濃度為60，12，6，2.40 g/L的條件下，回收率為50%～200%，供試品稀釋濃度為60 g/L時(shí)，回收率表現(xiàn)最好，且內(nèi)毒素檢測(cè)值準(zhǔn)確計(jì)算，能更好地反映供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量情況，故選擇稀釋質(zhì)量濃度為60 g/L為檢測(cè)質(zhì)量濃度。取批號(hào)為078160551，078160552，078160553的供試品，依法檢測(cè)，結(jié)果見表3。

2.4 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，采用0.25 EU/mL鱟試劑，根據(jù)公式C＝λ/L，將供試品溶液稀釋至1 g/L，采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果見表4。

3 討論

動(dòng)態(tài)濁度法是在凝膠法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法。目前，復(fù)合制劑在臨床的應(yīng)用越來越廣泛，諸如輸液反應(yīng)等也廣受關(guān)注，動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定復(fù)合制劑中細(xì)菌內(nèi)毒素含量為其臨床應(yīng)用提供了可靠參考[11]。此方法靈敏度高，操作便捷，一方面，檢測(cè)范圍較凝膠法寬，準(zhǔn)確定量，重復(fù)性好，可實(shí)時(shí)觀察與分析干擾試驗(yàn)和樣品檢測(cè)情況；另一方面，節(jié)約檢驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化操作環(huán)節(jié)，提高檢測(cè)效率。這些優(yōu)勢(shì)使該方法在藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的應(yīng)用中日益普遍。

本研究中采用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，試驗(yàn)中樣品在不同稀釋質(zhì)量濃度下，細(xì)菌內(nèi)毒素回收率均在50%～200%。采用動(dòng)態(tài)濁度法能準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，且樣品溶液在高質(zhì)量濃度就能排除干擾測(cè)得定量數(shù)據(jù)，稀釋倍數(shù)高于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，能準(zhǔn)確測(cè)定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。因此，本研究建立的注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法可行。

通過采用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定不同生產(chǎn)廠家樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，比較各樣品的內(nèi)毒素含量差異，可進(jìn)一步比較不同廠家的生產(chǎn)工藝及控制方法，可進(jìn)一步提升現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)。

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Content Determ ination of Bacterial Endotoxin in Am oxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection by K inetic Turbidim etric M ethod

Li Hui1,Zhang Yanli1,Cui Xiaoyan2,Liu Lin1,Liu Yun1
(1.Shijiazhuang Institute for Food and Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050031; 2.Hebei Provincial Institute for Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050011)

Ob jective To establish a method for determining the content of bacterial endotoxin in Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection.M ethods According to the Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition fourth section,kinetic turbidimetric method was used for the interference test of Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection and determining the content of bacterial endotoxin in samples.Results The interference was eliminated when the sample was diluted to 60 g/L,the recovery rate of bacterial endotoxin was within 50%－200%.Conclusion Dynamic turbidimetry can be used for bacterial endotoxin in test of Potassium Clavulanate and Amoxicillin for Injection,the content of bacterial endotoxin is less than the standard of Chinese Pharmacopoeia 0.25 EU/mg, and the current standard can be further improved.

Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection;bacteria endotoxin;kinetic turbidimetric method

R446.5

A

1006－4931(2017)09－0026－03

2016－11－23；

2017－02－04)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.008

李慧(1982－)，女，碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)及藥物分析，（電子信箱）190635814＠qq.com。