潘傳波，郭劍華，郭亮，李卿，馬善治，劉渝松，漆偉，劉才英，葉承莉，唐彥

（1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶400010；2.重慶市中藥研究院，重慶400065）

·實(shí)驗(yàn)研究·

正交試驗(yàn)法優(yōu)選四黃定痛貼提取工藝

潘傳波1，郭劍華1，郭亮1，李卿2，馬善治1，劉渝松1，漆偉1，劉才英1，葉承莉1，唐彥1

（1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶400010；2.重慶市中藥研究院，重慶400065）

目的優(yōu)化四黃定痛貼提取工藝。方法采用正交試驗(yàn)法，以鹽酸小檗堿為指標(biāo)，考察乙醇濃度、用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果最佳提取工藝為8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60 min。結(jié)論優(yōu)化的提取條件穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，適用于該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

四黃定痛貼；正交試驗(yàn)；鹽酸小檗堿；驗(yàn)證；提取工藝

痛風(fēng)為人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂所致疾病，隨著生活方式的改變，患病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為一種常見病、多發(fā)病。痛風(fēng)的病因主要有尿酸生成增多，排泄減少或含有易感基因3個(gè)方面，其中尿酸生成增多或排泄減少是原發(fā)性高尿酸血癥的主要病因。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性期表現(xiàn)為以關(guān)節(jié)紅腫熱痛為主，病及1個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)，伴發(fā)熱、舌紅、苔黃、脈數(shù)，高尿酸血癥是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要致病原因。四黃定痛貼是我院全國(guó)名老中醫(yī)傳承工作室專家郭劍華主任中醫(yī)師依據(jù)中醫(yī)的辨證論治并結(jié)合臨床實(shí)踐，通過療效觀察，不斷對(duì)處方優(yōu)化組合和劑量的配比擬訂的，由黃連、黃柏、獨(dú)活、乳香、沒藥、細(xì)辛組方，具有散寒祛濕、通經(jīng)止痛功效，主要用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。為使其質(zhì)量穩(wěn)定，便于攜帶和使用，將其改良為貼劑。由于處方藥味含有生物堿類、黃酮類、樹膠、環(huán)烯醚萜苷類等化合物，結(jié)合藥理動(dòng)物藥效學(xué)篩選試驗(yàn)結(jié)果，擬采取藥材乙醇回流提取法進(jìn)行提取工藝研究。本試驗(yàn)中采用L9(34)正交試驗(yàn)，以鹽酸小檗堿含量為測(cè)評(píng)指標(biāo)，優(yōu)化四黃定痛貼的提取工藝，為該制劑的規(guī)范化生產(chǎn)和臨床療效提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)為0713－9906，含量為98.14%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；藥材購(gòu)自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典(一部)》收載品種；乙腈、磷酸為色譜純；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

色譜柱：迪馬－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.03 moL/L磷酸二氫鈉－磷酸（28∶72∶0.08）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿對(duì)照品6.24 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并用甲醇定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。精密吸取對(duì)照品貯備溶液5.0m L，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：照處方比例稱取藥材，按正交試驗(yàn)進(jìn)行提取，濾過，合并濾液，濃縮至適量，加乙醇定容至500m L，搖勻。精密量取1.0mL，置25m L容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

缺黃連、黃柏的陰性對(duì)照品溶液：取不含黃柏的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制備，得陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間有相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照品溶液色譜無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對(duì)照無干擾，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

鑒于此，飛灰的固化穩(wěn)定化技術(shù)成為國(guó)內(nèi)外機(jī)構(gòu)廣泛研究的課題。目前，常用的固化方法有水泥固化法、熔融固化法和藥劑固化法等。藥劑固化法是利用化學(xué)藥劑通過化學(xué)反應(yīng)使有毒有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈腿芙庑浴⒌瓦w移性及低毒性物質(zhì)的過程。藥劑固化法流程如圖1所示。

線性關(guān)系考察：按測(cè)訂色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液2，4，8，10，16，20μL，進(jìn)樣測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積。以鹽酸小檗堿進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝2 084 472C－156 288.5，r＝0.999 9(n＝6)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.024 496～0.244 96μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10μL，按擬訂色譜條件分別于0，1，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.72%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿含量。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿含量為4.66%，RSD為1.04%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的同批樣品6份（鹽酸小檗堿含量為4.66%），分別加入不同濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液適量，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸小檗堿平均回收率為98.31%，RSD為0.84%（n＝6），詳見表1。

1.鹽酸小檗堿A.對(duì)照品溶液B.供試品溶液C.陰性對(duì)照品溶液圖1高效液相色譜圖

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 因素水平

以提取液中的鹽酸小檗堿為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)乙醇濃度（因素A）、乙醇量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表2。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3和表4。可見，各因素對(duì)提取效果均有影響，影響小檗堿提取因素中(C＞A＞B＞D)，最佳提取工藝為A2B2C3D1，即用8倍量60%乙醇，回流提取1次，提取60min。方差分析表明，C因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，A，B因素有一定影響，D因素?zé)o甚影響。從生產(chǎn)實(shí)際角度考慮，選擇用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.2.3 提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取藥材，采用擬采用工藝條件提取，照正交試驗(yàn)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鹽酸小檗堿含量。第1次小檗堿含量為4.67%，第2次為4.67%，第3次為4.66%?？梢姡辉囼?yàn)最優(yōu)提取工藝中，綜合考慮，小檗堿含量較高，可作為四黃定痛貼的提取方法，即用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇[1－4]

本處方中含黃連、黃柏、乳香、沒藥等多味藥材。其中，黃連、黃柏含生物堿成分，主要為小檗堿；梔子主要包括環(huán)烯醚萜苷類、二萜類(西紅花苷類)、有機(jī)酸酯類及其他類化合物；獨(dú)活根含白芷素、虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、牛防風(fēng)素、異虎耳草素、異佛手柑內(nèi)酯等多種呋喃香豆精類；乳香含大環(huán)二萜、四環(huán)三萜及五環(huán)三萜等多種揮發(fā)油類化學(xué)成分；沒藥含樹脂、揮發(fā)油、樹膠。提取工藝預(yù)試驗(yàn)曾考察水提取法、乙醇提取法，并比較鹽酸小檗堿含量和處方浸得收率，結(jié)果表明，采用乙醇提取法鹽酸小檗堿含量較高，而處方浸膏得率相對(duì)較少，結(jié)合本處方前期藥理動(dòng)物試驗(yàn)和藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，本處方提取工藝選用乙醇提取。

3.2 提取方法考選擇5－7]

滲漉法和熱回流提取法為乙醇提取的常用方法，該提取方法的考察以鹽酸小檗堿為檢測(cè)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果表明，滲漉提取法中鹽酸小檗堿含量與熱回流提取法中小檗堿含量基本接近，由于采用滲漉法提取需將藥材粉碎為一定細(xì)度，且生產(chǎn)過程需較長(zhǎng)時(shí)間，從工業(yè)化大生產(chǎn)角度考慮，采用熱回流提取法操作更簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率更高。故選用乙醇回流法作為提取方法。

3.3 檢測(cè)指標(biāo)選擇[8－9]

黃連藥材及以黃連藥材入藥的中藥成方制劑中，其提取工藝常用單一成分作為考察指標(biāo)，而黃連藥材中還含有其他多種生物堿類成分，如鹽酸藥根堿等；以黃連入藥的中藥成方制劑中由于成分更復(fù)雜，考慮的因素更多。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，以鹽酸小檗堿作為單一檢測(cè)指標(biāo)考察黃連藥材及其入藥的中藥成方制劑，與采用多成分、多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其所得優(yōu)化提取工藝基本一致。故本試驗(yàn)采用單一的鹽酸小檗堿含量作為優(yōu)化提取工藝的檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，方法簡(jiǎn)單可行，易于操作。

3.4 色譜條件選擇[10－17]

方法，測(cè)定鹽酸小檗堿液相色譜條件，多以離子對(duì)試劑作為流動(dòng)相，離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱及色譜儀影響較大。本試驗(yàn)中同時(shí)測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，經(jīng)優(yōu)化色譜條件，選用乙腈－0.03moL/L磷酸二氫鈉（含0.08%磷酸）為流動(dòng)相，方法簡(jiǎn)單，實(shí)用可行，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，目標(biāo)峰與相鄰峰分離度良好，能用于測(cè)定制劑中鹽酸小檗堿含量。

綜上所述，該中藥復(fù)方制劑是由黃連、黃柏、獨(dú)活等多味藥材組方，為便于攜帶，將原來的湯劑制為貼劑，保持了原方療效。采用乙醇提取法進(jìn)行制備，通過L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝參數(shù)，確定各項(xiàng)工藝條件，工藝穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

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Extraction Technology Op tim ization of Sihuang Dingtong Patch by O rthogonal Test

Pan Chuanbo1,Guo Jianhua1,Guo Liang1,Li Qing2,Ma Shanzhi1,Liu Yusong1,Qi Wei1,Liu Caiying1,Ye Chengli1,Tang Yan1
(1.Chongqing traditional Chinese medicine orthopaedics hospital,Chongqing,China 400010; 2.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing,China 400065)

Objective To optimize the extraction technology of Sihuang Dingtong Patch.M ethods The orthogonal test was performed to investigate the effects of ethanol concentration,ethanol amount,extraction times and extraction time on the extraction results with the content of berberine hydrochloride as the evaluation index.Resu lts The best optimum conditions were as follows:the amount of ethanol 8 times,60%was used as the extraction solvent,extraction times 3 times and the extraction duration for each time was 60 min.Conclusion The optimized extraction technology of Sihuang Dingtong Patch is stable,feasible and reproducible,which can apply to the production of Sihuang Dingtong Patch.

Sihuang Dingtong Patch;orthogonal test;berberine hydrochloride;verification;extraction technology

TQ460.6

A

1006－4931(2017)09－0013－04

2017－01－10；

2017－02－18)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.004

重慶市衛(wèi)生和計(jì)生委中醫(yī)藥科技項(xiàng)目[ZY20150227]。

潘傳波，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楣残l(wèi)生服務(wù)與衛(wèi)生事業(yè)管理，（電話）023－63930833（電子信箱）panchbo＠tom.com。