蔣夢(mèng)彤唐瑞雪羅殿中

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

m iR-10b-5p作用于胰腺癌潛在靶基因及分子機(jī)制的探討

蔣夢(mèng)彤1，2唐瑞雪1羅殿中1

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的探討miR-10b-5p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中潛在的靶基因和分子機(jī)制。方法通過高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫和在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在靶基因進(jìn)行初步探討，再利用生物信息學(xué)計(jì)算，對(duì)miR-10b-5p與靶基因間的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果本研究共得到586個(gè)miR-10b-5p潛在靶基因。基因富集分析（gene ontology，GO）表明，靶基因主要在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中富集。京都基因與基因組百科全書通路分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）顯示miR-10b-5p靶基因主要存在于兩個(gè)重要途徑：癌癥相關(guān)通路和胰腺癌相關(guān)通路。蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（protein-protein interaction，PPI）重點(diǎn)展示了胰腺癌相關(guān)通路上7個(gè)突變基因（EGFR、RAC3、SMAD4、PIK3CA、CDK6、Bcl2L1和STAT3）之間的相互作用關(guān)系。結(jié)論miR-10b-5p可能通過靶向潛在的基因和途徑在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

胰腺腫瘤；miR-10b-5p；生物信息學(xué)；靶基因；分子機(jī)制

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。其中胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）占全部胰腺癌的90%以上，惡性程度極高，5年存活率極低。影響胰腺癌不良預(yù)后的因素有以下三種：一是目前對(duì)胰腺癌仍缺乏有效的篩選測(cè)試；二是胰腺癌早期幾乎沒有任何癥狀；三是胰腺癌對(duì)現(xiàn)有的大部分化療方案都具有較高的抗藥性。因此胰腺癌患者需要更加個(gè)性化的治療方法。

微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源的非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們可以通過結(jié)合mRNA的3′-UTR區(qū)域中的互補(bǔ)序列誘導(dǎo)靶向mRNA降解或抑制mRNA翻譯調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)［1］。miRNA可以作為致癌基因或腫瘤抑制基因起作用，成為治療的新靶點(diǎn)［2］。研究發(fā)現(xiàn)miR-10b-5p在乳腺癌［3］、結(jié)直腸癌［4］、胃癌［5］、肝細(xì)胞癌［6］、小細(xì)胞肺癌［7］、胰腺癌［8］和神經(jīng)胰腺癌［9］等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。然而，尚無研究報(bào)道m(xù)iR-10b-5p調(diào)控胰腺癌的具體分子機(jī)制。本研究通過高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫和在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫，確定了miR-10b-5p的潛在靶基因。并通過生物信息學(xué)分析，進(jìn)行基因富集分析（geneontology，GO）、京都基因與基因組百科全書通路分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（protein-protein interaction，PPI），探索miR-10b-5p及其靶基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 在線靶基因的預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因收集

采用包括DIANA-microTv 4.0、DIANA-microTCDS、miRanda-rel 2010、miRanda-rel 2010、miRDB 4.0、miRmap、miRNAMap、PicTar2、PITA，RNA22v2，RNAhybrid 2.1和Targetscan 6.2在內(nèi)的12個(gè)在線miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-10b-5p靶基因。整合結(jié)果后，計(jì)算預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫中每個(gè)靶基因的頻率。采用表達(dá)差異倍數(shù)（fold-change，F(xiàn)C）以及t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，挑選條件：FC>2且P<0.05，各數(shù)據(jù)庫所預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行取交集處理。此外，還收集了來自miRTarbase和Tarbase實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的目標(biāo)基因，挑選條件與上述12個(gè)在線網(wǎng)站的篩選條件相同，所得靶基因與上述靶基因進(jìn)行取交集處理。

1.2 潛在的重要靶基因收集

首先在GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)以“miR-10b ormiRNA-10b or microRNA-10b”和“pancreatic cancer or PDAC”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，去掉非人類研究和重復(fù)的樣本信息，最終提取納入基因序列的原始數(shù)據(jù)，通過Excel表格軟件匹配相應(yīng)基因ID的基因名稱，選取Log2（FC）>0的差異基因?yàn)榘谢?，并移除重?fù)。最后對(duì)此部分所得靶基因與第一部分所得的靶基因取交集處理，兩部分重復(fù)出現(xiàn)的差異基因最終即為miR-10b-5p的靶基因。

1.3 GO分析和KEGG分析

利用在線工具網(wǎng)站DAVID（https：//david.ncifcrf. gov/）完成基因富集分析和基因通路富集分析。將上述最終的靶基因上傳到DAVID中，即可收集到重要的富集基因和基因通路，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析

將最終的靶基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（http：// www.string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)?；?dòng)評(píng)分>0.4作為中等互動(dòng)置信度的閾值。

2 結(jié)果

2.1 潛在靶基因的探索

通過12個(gè)在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫、miRTarbase和Tarbase實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的基因數(shù)據(jù)庫，共收集到2 969個(gè)預(yù)測(cè)靶基因。另外，通過關(guān)鍵詞檢索，在GEO數(shù)據(jù)庫中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)合格的數(shù)據(jù)系列：GSE40189。該系列是對(duì)胰腺癌PDAN-1細(xì)胞系進(jìn)行處理，其中三組樣本為miR-10b-5p沉默組，另有三組為miR-10b-5p過表達(dá)組。匹配好基因ID和基因名稱后，對(duì)同一基因的三組表達(dá)值取平均值，對(duì)沉默組與過表達(dá)組表達(dá)值之比進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)處理，經(jīng)過篩選，共得到4 352個(gè)差異基因。進(jìn)一步比較來自GEO芯片的差異基因和預(yù)測(cè)的靶基因，發(fā)現(xiàn)重復(fù)的基因有586個(gè)。這586個(gè)基因最終被認(rèn)為是胰腺癌中一組關(guān)鍵的miR-10b-5p靶基因，并以此行進(jìn)一步生物信息學(xué)分析。

2.2 GO和KEGG分析

通過DAVID功能注釋模塊注釋后，重點(diǎn)分析上述586個(gè)靶基因。GO和KEGG分析顯示這些基因存在多種潛在的機(jī)制通路。其中富集最顯著的生物過程為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，最重要的兩個(gè)途徑為癌癥相關(guān)通路和胰腺癌相關(guān)通路。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

PPI網(wǎng)絡(luò)能根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的富集程度幫助確定最重要的靶基因之間的相互作用關(guān)系，即關(guān)鍵基因間的互作關(guān)系?；谏鲜鰧?duì)潛在靶基因的探索和富集通路機(jī)制的預(yù)測(cè)，本研究對(duì)存在于癌癥相關(guān)通路上的靶基因（RASSF1、CASP8、ITGA2、CRK、CBL、PLCG1、CDK6、PTEN、PIKSCA、XIAP、RUNX1、MMP9、EGFR、BCR、IGFIR，Bcl2L1、CTNNA1、CTNNB1、RAC3，STAT3、CTBP1、SMAD4、ARHGEF11、HIF1A、PIAS2，DVL3、F2D1、RXRA）和存在于胰腺癌相關(guān)通路上的靶基因（EGFR、RAC3、SMAD4、PIK3CA、CDK6、Bcl2L1、STAT3）構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1、圖2）。

圖1 癌癥相關(guān)通路的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果（hsa05200）

圖2 胰腺癌相關(guān)通路的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果（hsa05212）

3 討論

據(jù)2017腫瘤年報(bào)報(bào)道，胰腺癌的發(fā)病率在女性中居第9位，而死亡率在男性和女性中均位于第4位［10］，這與缺乏有效的早期診斷和治療有關(guān)，大多患者確診時(shí)已處于晚期階段，而目前的治療方法仍以手術(shù)治療為主，但手術(shù)切除只能對(duì)處于早期尚未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者有效。隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展，人們逐漸將目光聚焦到胰腺癌的分子靶向治療。特異地影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，是幫助胰腺癌早期診斷和治療的關(guān)鍵。目前的研究表明miR-10b-5p在胰腺癌中的表達(dá)存在顯著差異，提示miR-10b-5p可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代，這為人類各種惡性腫瘤的研究提供了更加廣闊的平臺(tái)。GEO數(shù)據(jù)庫是支持符合MIAME標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)提交的公共的功能基因組數(shù)據(jù)庫。GO富集分析和KEGG通路分析都有助于確定目標(biāo)基因和其富集的分子通路。PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作是基于所提供基因，經(jīng)過已有研究在線分析后，進(jìn)一步挖掘富集的多個(gè)基因之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步揭示這些關(guān)鍵基因如何彼此影響而在腫瘤相關(guān)機(jī)制通路中發(fā)揮作用。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了miR-10b-5p作用于胰腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中潛在的靶基因有586個(gè)，比較有趣的是這些基因所富集的最顯著的生物學(xué)過程為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，密切相關(guān)的通路機(jī)制癌癥相關(guān)通路和胰腺癌相關(guān)通路。尤其是胰腺癌相關(guān)通路上，存在EGFR、RAC3、SMAD4、PIK3CA、CDK6、Bcl2L1和STAT3 7個(gè)明顯差異的基因。

表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGFR）是具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ERBB家族的跨膜受體成員。EGFR通過激活RAS/MAP激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducerand activatorof transcription，STAT）、磷脂酶C/蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3′-激酶（phosphatidy inositol 3-kinase，PI3K）/AKT途徑參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、黏附分化和細(xì)胞存活［11］。以往的研究發(fā)現(xiàn)EGFR在超過90%的胰腺癌樣本中過表達(dá)?；谶@一發(fā)現(xiàn)，靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑被認(rèn)為是有效的治療藥物。其中，厄洛替尼已被FDA批準(zhǔn)與吉西他濱聯(lián)合作為晚期胰腺癌的一線治療藥物［12］。另外STAT3參與多種抗腫瘤免疫應(yīng)答的過程，是STAT家族中較為關(guān)鍵的分子之一［13］。已有研究表明超過90%的胰腺癌中存在K-RAS基因突變，而降低STAT3的表達(dá)，可明顯抑制K-RASG12D的突變活性，并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡［14］。SMAD4是SMAD家族信號(hào)的成員之一，并且是轉(zhuǎn)化因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)通路的中樞介質(zhì)。有研究指出，在60%～90%的胰腺癌中發(fā)現(xiàn)SMAD4失活或喪失［15］。SMAD4基因的等位基因丟失導(dǎo)致其突變和降解，從而激活TGF-β依賴性途徑，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡減少，并促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［16］。因此，TGF-SMAD4信號(hào)在胰腺癌細(xì)胞中被認(rèn)為起腫瘤抑制因子的作用［17］。而CD6/CD4抑制劑可以增加SMAD的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲力［18］。PIK3CA又稱PI3K，RAS的激活可以使PIK3CA磷酸化，并依次激活A(yù)KT、絲氨酸/蘇氨酸激酶。PIK3CA/ AKT信號(hào)通路的激活，在胰腺癌細(xì)胞增殖、代謝和存活中發(fā)揮作用。而這一過程的發(fā)生依賴下游靶基因發(fā)揮作用，如雷帕霉素（mTOR）靶標(biāo)［19］。目前mTOR抑制劑對(duì)胰腺癌療效的臨床試驗(yàn)評(píng)估仍在進(jìn)行中［20-21］。而有趣的是，有研究指出，將Bcl-2/Bcl-XL（Bcl2/Bcl2L1）抑制劑與PIK3CA抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于胰腺癌細(xì)胞模型，相比單用時(shí)具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷力［22］。肝細(xì)胞核因子-1（hepatocyte nuclear factor-1，HNF-1）在胰腺B細(xì)胞基因調(diào)控中起調(diào)控作用，且HNF-1可與RAS相關(guān)C3肉毒桿菌底物3（RAC3）特異性結(jié)合，激活一系列轉(zhuǎn)錄機(jī)制，因此RAC3被認(rèn)為是影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展?jié)撛诘恼{(diào)節(jié)分子，但RAC3參與胰腺癌調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證［23］。

綜上所述，EGFR、RAC3、SMAD4、PIK3CA、CDK6、Bcl2L1和STAT3等7個(gè)基因就目前研究提示是調(diào)節(jié)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子，同時(shí)具有彼此相互影響作用。本研究通過生物信息學(xué)的方式將它們之間潛在的關(guān)系挖掘出來，并提示其作用機(jī)制都是通過調(diào)節(jié)miR-10b-5p產(chǎn)生，為進(jìn)一步研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及胰腺癌的治療提供了新的思路和初步依據(jù)。然而本研究仍存在局限性，例如所有分析都是通過生物信息學(xué)計(jì)算完成，缺乏體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。因此，該結(jié)果仍然需進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Lawlor H，Meunier A，McDermott N，et al.Identification of suitable endogenous controls for gene and miRNA expression studies in irradiated prostate cancer cells［J］.Tumour Biol，2015，36（8）：6019-6028.

［2］Winsel S，Maki-Jouppila J，Tambe M，et al.Excess ofmiRNA-378a-5p perturbs mitotic fidelity and correlates with breast cancer tumourigenesis in vivo［J］.Br JCancer，2014，111（11）：2142-2151.

［3］Bertoli G，Cava C，Castiglioni I.MicroRNAs：new biomarkers for diagnosis，prognosis，therapy prediction and therapeutic tools for breast cancer［J］.Theranostics，2015，5（10）：1122-1143.

［4］Jiang H，Liu J，Chen Y，et al.Up-regulation of mir-10b predicate advanced clinicopathological featuresand livermetastasis in colorectal cancer［J］.Cancer Med，2016，5（10）：2932-2941.

［5］Huang Z，Zhu D，Wu L，et al.Six serum-based miRNAs as potential diagnostic biomarkers for gastric cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2017，26（2）：188-196.

［6］Liao CG，Kong LM，Zhou P，et al.miR-10b is overexpressed in hepatocellular carcinoma and promotes cell proliferation，migration and invasion viaRhoC，uPARand MMPs［J］.JTranslMed，2014，12：234.

［7］Zhang J，Xu L，Yang Z，et al.MicroRNA-10b indicates a poor prognosis of non-small cell lung cancer and targets E-cadherin［J］.Clin Transl Oncol，2015，17（3）：209-214.

［8］Ouyang H，Gore J，Deitz S，et al.microRNA-10b enhances pancreatic cancer cell transmission by suppressing TIP30 expression and promoting EGF and TGF-βactions［J］.Oncogene，2014，33（38）：4664-4674.

［9］Zhang X，Cheng J，F(xiàn)u L，et al.Overexpression of tissue microRNA10b may help predict glioma prognosis［J］.J Clin Neurosci，2016，29：59-63.

［10］SiegelRL，Miller KD，JemalA.CancerStatistics，2017，［J］.CA Camcer JClin，2017，67（1）：7-30.

［11］Fitzgerald TL，Lertpiriyapong K，Cocco L，et al.Roles of EGFR and KRAS and their downstream signaling pathways in pancreatic cancer and pancreatic cancer stem cells［J］.Adv Biol Regul，2015，59：65-81.

［12］Tobita K，Kijima H，Dowaki S，et al.Epidermal growth factor receptor expression in human pancreatic cancer：significance for livermetastasis［J］.Int JMol Med，2003，11（3）：305-309.

［13］Wang S，AnW，Yao Y，etal.Interleukin 37 expression inhibits STAT3 to suppress the proliferation and invasion of human cervical cancer cells［J］.JCancer，2015，6（10）：962-969.

［14］Rabi T，Catapano CV.Aphanin，a triterpenoid from Amoora rohituka inhibits K-Rasmutant activity and STAT3 in pancreatic carcinoma cells［J］.Tumour Biol，2016，37（9）：12455-12464.

［15］Moustakas A，Heldin CH.Non-smad TGF-beta signals［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 16）：3573-3584.

［16］Lin X，F(xiàn)eng XH.Abrogation of transforming growth factor-signaling in pancreatic cancer［J］.World JSurg，2005，29（3）：312-316.

［17］Ahmed S，Bradshaw AD，Gera S，et al.The TGF-β/Smad4 signaling pathway in pancreatic carcinogenesisand its clinical significance［J］. JClin Med，2017，6（1）：E5.

［18］Liu F，Korc M.Cdk4/6 inhibition induces epithelial mesenchymal transition and enhances invasiveness in pancreatic cancer cells［J］. Mol Cancer Ther，2012，11（10）：2138-2148.

［19］Hezel AF，Kimmelman AC，Stanger BZ，et al.Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Genes Dev，2006，20（10）：1218-1249.

［20］Wolpin BM，Hezel AF，Abrams T，et al.OralmTOR inhibitor everolimus in patients with gemcitabinerefractory metastatic pancreatic cancer［J］.JClin Oncol，2009，27（2）：193-198.

［21］Kordes S，Klümpen HJ，Weterman MJ，etal.Phase IIstudy of capecitabine and the oral mTOR inhibitor everolimus in patients with advanced pancreatic cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2015，75（6）：1135-1141.

［22］Tan N，Wong M，NanniniMA，et al.Bcl-2/Bcl-xL inhibition increases the efficacy of MEK inhibition alone and in combination with PI3 kinase inhibition in lung and pancreatic tumor models［J］.Mol Cancer Ther，2013，12（6）：853-864.

［23］Soutoglou E，Papafotiou G，Katrakili N，et al.Transcriptional activation by hepatocyte nuclear factor-1 requires synergism between multiple coactivator proteins［J］.J Biol Chem，2000，275（17）：12515-12520.

［2017-03-24收稿］［2017-04-16修回］［編輯江德吉］

Identification of potential target genes and m olecu lar m echanism s of m iR-10b-5p in pancreatic cancer

Jiang Mengtong1，2，Tang Ruixue1，Luo Dianzhong1（1Department of Pathology，F(xiàn)irstAffiliated HospitalofGuangxiMedicalUniversity；2Graduate School of GuangxiMedica University，Nanning 530021，P.R.China）

Luo Dianzhong.E-mail：13878802796＠163．com

Objective We aimed to explore target genes and molecularmechanisms potentially affected bymiR-10b-5p in the developmentof pancreatic cancer.Methods We predicted potential targetgenesaffected bymiR-10b-5p using theGene Expression Omnibus database and other online prediction databases.Results A total of 586 candidate target genes were identified，and Gene Ontology enrichment analysis showed thatmany target genes are involved in protein transport.Pathway analysis using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes suggested that miR-10b-5p is involved in tumor-associated pathways as well as specifically in pancreatic cancer-related pathways.Network analysis using the Protein-Protein Interaction tool suggested interactions among seven mutant genes（EGFR，RAC3，SMAD4，PIK3CA，CDK6，Bcl2L1，STAT3）in pancreatic cancer-related pathways.Conclusions The microRNA miR-10b-5p may target genes and pathways involved in pancreatic cancer，potentially making it important in diagnosis and treatment of the disease.

Pancreatic neoplasms；miR-10b-5p；Bioinformatics；Target genes；Molecularmechanism

R735.9

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660424）

羅殿中。E-mail：13878802796＠163．com