阮光萍 劉菊芬 李自安 王金祥 龐榮清 潘興華

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對獼猴糖尿病治療效果的研究

阮光萍 劉菊芬 李自安 王金祥 龐榮清 潘興華

目的通過用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（huMSCs）治療獼猴糖尿病模型觀察其血糖的變化。方法獼猴9只，分為對照組3只和模型組6只，模型組通過高糖高脂飲食及靜脈注射鏈尿佐菌素（STZ）誘導(dǎo)成糖尿病模型，兩組間比較用t檢驗。12周時再分為模型對照組3只和治療組3只，治療組每只每周靜脈回輸huMSCs 1×106個/kg，連續(xù)3周，每周檢測各組血糖變化，三組間比較用方差分析。結(jié)果兩組獼猴高糖高脂飲食喂養(yǎng)第8周時模型組空腹血糖值 [（22.00±3.00）mmol/L] 與對照組 [（4.75±0.20）mmol/L] 相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 9.94，P ＜ 0.01）。40周時1只獼猴因糖尿病死亡，病理切片證實心、肝、脾、肺、腎和胰腺均有病變，符合糖尿病特征。huMSCs治療后，3周血糖連續(xù)下降，到第4周對照組、模型組、治療組空腹血糖分別為（4.85±0.35）mmol/L、（18.20±1.00）mmol/L、（4.09±0.50）mmol/L，3 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 388.10，P ＜ 0.01）。兩兩比較結(jié)果表明對照組和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 24.173，P ＜ 0.01），模型組與治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 25.549，P = 0.014）。結(jié)論STZ聯(lián)合高糖高脂飼料能成功誘導(dǎo)出獼猴糖尿病模型，用huMSCs能有效降低血糖，使糖尿病獼猴恢復(fù)正常血糖，方法簡便。

獼猴屬； 糖尿??； 病理切片； 血糖； 臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞移植

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的代謝性疾病，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后第3位嚴(yán)重的慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病將成為我國經(jīng)濟和社會發(fā)展的障礙。

糖尿病是一種代謝紊亂疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，與發(fā)達(dá)國家相比，我國糖尿病患者的絕對數(shù)已居世界首位[2-3]。尋找、開發(fā)高效的治療糖尿病藥物和全新的干細(xì)胞治療方案，有極其深遠(yuǎn)的意義[4-5]。但在進(jìn)行藥效學(xué)研究時，如何建立理想、穩(wěn)定的糖尿病動物模型，是許多研究者必須進(jìn)行的前期工作。

復(fù)制與人體接近的糖尿病實驗動物模型是進(jìn)行糖尿病研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，本實驗用與人類最為接近的靈長類動物獼猴做為實驗動物，將研究在高糖高脂飼料喂養(yǎng)條件下聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)獼猴糖尿病模型的建立。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，huMSCs）具有分泌造血生長因子、重建造血微環(huán)境、低免疫原性、易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)等優(yōu)點，將其應(yīng)用于獼猴糖尿病模型的臨床治療具有十分廣闊的前景。而通過移植huMSCs治療糖尿病獼猴，并觀察療效和安全性，如果huMSCs用于糖尿病獼猴是安全有效的，那么用于人類的糖尿病將更加安全和有效。

材料與方法

一、獼猴糖尿病模型的建立及評價

獼猴9只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所，分為對照組3只和模型組6只，模型組給予高糖高脂飲食4周，然后靜脈注射STZ，STZ先用0.1 mmol/L，pH值為4.3的檸檬酸鹽緩沖液配成100 mg/ml濃度，獼猴稱重后按30 mg/kg的劑量靜脈注射STZ。注射后獼猴血糖升高，成模標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖≥11.1 mmol/L連續(xù)4周。實驗步驟通過昆明總醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

成模后獼猴表現(xiàn)為多飲多食多尿體重減輕等典型糖尿病癥狀。1只獼猴因糖尿病癥狀明顯，多飲多食多尿體重減輕，在40周時死亡，取心、肝、脾、肺、腎、胰腺做病理切片HE染色，觀察糖尿病的內(nèi)臟病變。另外，在對照組隨機挑選1只獼猴，麻醉后，進(jìn)行活檢，取心、肝、脾、肺、腎、胰腺少許做病理切片HE染色，做為正常對照的結(jié)果。

病理切片HE染色按照常規(guī)方法進(jìn)行，HE切片觀察由專業(yè)人士進(jìn)行。

二、huMSCs的分離培養(yǎng)

無菌留取huMSCs，用組織剪把臍帶剪成長約2 ～ 3 cm的小段，剔除臍靜動脈，沖去殘余血跡，將臍帶剪碎至1 ～ 2 mm3大小的組織塊，接種于含DMEM/F-12完全培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2 ～4 d換液1次，待有成纖維樣細(xì)胞爬出后1 ～ 2周去掉組織塊。顯微鏡下觀察細(xì)胞長至80%～ 90%融合時，用PBS緩沖液沖洗，含0.25%胰蛋白酶的消化液消化細(xì)胞，收集所得細(xì)胞即為原代細(xì)胞。將收集的原代細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后棄上清液，加入適量DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，以1：1的比例傳代培養(yǎng)，計為第1代（Passage1，P1）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。用第4代細(xì)胞進(jìn)行移植治療。

三、huMSCs移植治療獼猴糖尿病模型

將第4代細(xì)胞消化下來，計數(shù)，給3只糖尿病模型獼猴靜脈回輸，按每公斤體重每只回輸1×106個huMSCs，連續(xù)回輸3周，每周檢測3組獼猴的血糖變化，觀察huMSCs治療獼猴糖尿病的療效及安全性。模型對照組輸注生理鹽水。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

圖1 經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)后兩組獼猴空腹血糖結(jié)果

圖2 經(jīng)huMSCs治療后3組獼猴空腹血糖結(jié)果比較

表1 經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)后2組獼猴0 ～ 6周空腹血糖的結(jié)果（mmol/L，±s）

表1 經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)后2組獼猴0 ～ 6周空腹血糖的結(jié)果（mmol/L，±s）

分組 只數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周對照組 3 4.80±0.20 4.90±0.30 5.00±0.10 5.10±0.30 4.90±0.10 5.20±0.20 4.95±0.40模型組 6 4.90±0.40 15.00±1.00 16.00±2.00 17.00±3.00 19.00±2.00 18.00±1.00 20.00±4.00 t 值 0.39 16.76 9.51 6.84 12.20 21.74 6.48 P值 0.72 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01分組 只數(shù) 7周 8周 9周 10周 11周 12周對照組 3 4.85±0.30 4.75±0.20 4.70±0.10 4.60±0.20 4.90±0.30 4.86±0.25模型組 6 21.00±5.00 22.00±3.00 21.00±2.00 20.00±4.00 19.00±2.00 18.00±1.00 t 值 5.58 9.94 14.10 6.66 12.08 22.08 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 經(jīng)huMSCs治療后3組獼猴空腹血糖的結(jié)果（mmol/L，±s）

表2 經(jīng)huMSCs治療后3組獼猴空腹血糖的結(jié)果（mmol/L，±s）

注 ：與對照組比較，aP ＜ 0.01，與模型組比較bP ＜ 0.01

分組 只數(shù) 1周 2周 3周 4周對照組 3 4.65±0.20 4.75±0.30 4.80±0.40 4.85±0.35模型組 3 22.90±4.00a18.90±3.00a 19.80±2.00a 18.20±1.00a治療組 3 19.70±1.00a 13.40±0.8ab7.50±0.90ab4.09±0.50bF值 50.16 47.07 115.77 388.10 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

結(jié) 果

一、兩組獼猴空腹血糖的檢測結(jié)果

兩組獼猴從高糖高脂飲食喂養(yǎng)開始，觀察0 ～ 12 周的空腹血糖變化（圖 1，表 1），空腹血糖≥11.1 mmol/L連續(xù)4周即診斷為獼猴糖尿病。

二、huMSCs治療后每周3組獼猴血糖檢測結(jié)果

huMSCs連續(xù)治療3周，從第1周開始每周檢測空腹血糖，連續(xù)檢測4周，到最后一次治療后1周，治療組空腹血糖降至正常（圖2，表2）。

三、病理組織結(jié)構(gòu)變化

模型組肺組織實質(zhì)化，肺組織結(jié)構(gòu)消失（圖3a），正常對照組肺臟結(jié)構(gòu)正常（圖3b）；模型組肝組織可見多處局灶性肝細(xì)胞壞死（圖3c），正常對照組肝臟結(jié)構(gòu)正常（圖3d）；模型組脾小結(jié)區(qū)組織壞死，結(jié)構(gòu)紊亂（圖3e），正常對照組脾臟結(jié)構(gòu)正常（圖3f）；模型組部分腎小管水腫，近曲小管刷狀緣脫落（圖3g），正常對照組腎臟結(jié)構(gòu)正常（圖3h）；模型組局部心肌細(xì)胞核固縮，胞漿淡染，細(xì)胞壞死（圖3i），正常對照組心臟結(jié)構(gòu)正常（圖3g）；模型組胰島結(jié)構(gòu)纖維化改變（圖3k），正常對照組胰腺結(jié)構(gòu)正常（圖 3l）。

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組獼猴肺、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胰腺病理切片（HE染色，×100)

討 論

目前，在糖尿病的研究中，國內(nèi)外學(xué)者的實驗已證實高熱量飲食+STZ注射是復(fù)制糖尿病動物模型的重要條件[6]。

STZ引起糖尿病的機理至今仍未完全了解清楚，可能有以下機制參與糖尿病的形成：（1）STZ直接破壞胰島β細(xì)胞；（2）STZ激活自身免疫過程，進(jìn)一步導(dǎo)致β細(xì)胞的損害；（3）通過一氧化氮（NO）和自由基兩種途徑損傷胰島β細(xì)胞[7]。

STZ大劑量注射時，由于直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型；而注射較少量STZ時，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對胰島素不敏感，同時給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類2型糖尿病的動物模型[8-9]。

在糖尿病治療的研究中，糖尿病動物模型的建立是關(guān)鍵的一步，動物模型建立的成功與否直接關(guān)系到后續(xù)的研究[10]。本實驗所建立的獼猴糖尿病模型方法簡單易行且穩(wěn)定性好，適用于糖尿病及其慢性并發(fā)癥的長期發(fā)病機制研究。

目前，復(fù)制實驗性糖尿病模型的方法很多[11-12]，有胰腺切除法，化學(xué)誘導(dǎo)法，病毒誘導(dǎo)法等，國內(nèi)最常用的是化學(xué)誘導(dǎo)法，常用藥物有四氧嘧啶和STZ。STZ是一種廣譜抗菌素，具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用。引起糖尿病的主要機制是STZ對胰島β細(xì)胞的毒性作用，首先是將DNA堿基上的特殊位點烷基化再作用于ADP核糖體合成酶，導(dǎo)致多聚ADP2核糖體激活，胞內(nèi)NAD+和ATP耗竭，最終導(dǎo)致大量反應(yīng)性氧簇產(chǎn)生，引起胰島β細(xì)胞特異性損傷。

huMSCs已經(jīng)在一些動物糖尿病治療研究中證實具有類似作用，關(guān)于huMSCs修復(fù)獼猴糖尿病損傷的研究未見報道。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，huMSCs有治療獼猴糖尿病的作用，參與損傷組織的修復(fù)。關(guān)于huMSCs治療獼猴糖尿病的研究結(jié)果提示，干細(xì)胞再生修復(fù)可能成為獼猴糖尿病治療的有效手段。本研究表明異種間移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞沒有免疫排斥，安全性好，療效明顯。

本研究利用與人類最為接近的靈長類動物，獼猴模型的成功建立為闡明人類糖尿病的發(fā)病機制與病理變化有較為重要的意義，獼猴糖尿病模型的建立為人類評價全新的糖尿病治療方案打下了較好的基礎(chǔ)，今后糖尿病的治療不僅局限于藥物療效的篩選，還為干細(xì)胞治療糖尿病的療效及機制提供了較好的動物模型。

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Safety and efficacy of human umbilical cord mesenchymal stem cells for diabetes in macaques

Ruan Guangping, Liu Jufen, Li Zi’an, Wang Jinxiang, Pang Rongqing, Pan Xinghua.
the Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chendu Military Commend, the Integrated Engineering laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, the Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, the Stem Cell Engineering laboratory of Yunan Province, Kunming 650032, China

Pan Xinghua, Email:xinghuapan@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the safety and efficacy of human umbilical cord mesenchymal stem cells（huMSCs）in the macaque model of diabetes.MethodsNine macaques were divided into either control group（n = 3）or model group（n = 6）. Diabetes was induced by high-sugar, high-fat diet and intravenous injection of streptozotocin（STZ）. Comparison between the two groups was performed using t test. At 12 weeks diabetic macaques were subdivided into the model control group（n = 3）and the treatment group（n = 3）, and the treatment group was given weekly intravenous transfusion of 1×106huMSCs per kilogram of body weight for 3 weeks.Blood sugar levels were measured weekly. Comparison among the three groups was performed using variance analysis.ResultsAt the 8th week, the fasting blood glucose level increased significantly in the model group（22.00±3.00）mmol/L. Compared with the control group（4.89±0.16）mmol/L,the difference was statistically significant（t = 9.94, P ＜ 0.01）. A monkey died due to diabetes at 40 weeks. Pathological examination showed heart, liver, spleen, lungs, kidneys and pancreas had thecharacteristics of diabetes. After huMSCs therapy, blood sugar continuously declined for 3 weeks. At the fourth week, the fasting blood glucose of the control group, the model group and the treatment group were 4.85±0.35 mmol/L, 18.20±1.00 mmol/L, and 4.09±0.50 mmol/L respectively. There was significant difference between the control group and the model group（t = 24.173, P ＜ 0.01）,and between the model group and the treatment group（t = 25.549, P = 0.014）.ConclusionSTZ and high-sugar, high-fat diet can induce diabetes in macaques. HuMSCs is simple and effective in treating diabetes.

Macaca; Diabetes mellitus; Pathological section; Blood glucose;Umbilical cord; Mesenchymal stem cell transplantation

2016-08-02）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.002

國家科技支撐計劃（2014BI01B01）；云南省科技計劃重點項目（2013CA005）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃重點項目（2015FA039）

650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心 干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室 云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室

潘興華，Email：xinghuapan@aliyun.com

阮光萍，劉菊芬，李自安，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對獼猴糖尿病治療效果的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：131-135.