方圓董智慧魏征符偉國潘天岳顧史洋陳斌郭大喬徐欣劉澎蔣俊豪楊玨

自體干細(xì)胞對常規(guī)血運(yùn)重建失敗的重度肢體缺血患者的療效觀察

方圓1董智慧1魏征2符偉國1潘天岳1顧史洋2陳斌1郭大喬1徐欣1劉澎2蔣俊豪1楊玨1

目的回顧性分析自體干細(xì)胞移植治療常規(guī)血運(yùn)重建失敗的重度肢體缺血患者的有效性。方法收集2009年5月至2015年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科14例盧瑟福4 ～ 5級肢體缺血患者，術(shù)前均曾接受常規(guī)血運(yùn)重建治療，包括人工血管旁路術(shù)、動脈支架植入術(shù)等，中位年齡（48±15）歲，術(shù)后缺血無顯著改善，或短期內(nèi)復(fù)發(fā)。接受GCSF動員5 d后，進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞采集，獲得移植物后，肌肉注射于缺血肢體。接受純化CD34+細(xì)胞移植治療共計11例，外周血單個核細(xì)胞移植治療共計3例。術(shù)后12個月保肢率使用Kaplan-Meier生存分析法分析，治療前后疼痛評分、無痛步行時間差異比較采用配對t檢驗。結(jié)果14例均獲隨訪，平均（42±25）個月（12 ～ 74個月），1例死亡，2例截肢，死亡及截肢患者均為老年下肢動脈硬化閉塞癥患者。術(shù)后2年總體生存率92.86%（13/14），無截肢生存率78.57%（11/14）。術(shù)前平均無痛步行時間（3±2）min，術(shù)后 6 個月（12±8）min，較術(shù)前顯著改善（P ＜ 0.05，F(xiàn) = 14.95）。術(shù)前平均Wong-Baker疼痛評分為7±1，平均靜息痛緩解起始時間為術(shù)后（3±1）周，術(shù)后6個月疼痛評分為1±1，較術(shù)前顯著改善（P ＜ 0.05，F(xiàn) = 18.00）。結(jié)論自體干細(xì)胞移植治療常規(guī)血運(yùn)重建失敗的重度肢體缺血患者安全有效。

外周血管疾??； 缺血； 干細(xì)胞移植； 移植，自體

隨著生活水平的提高，人口老齡化，糖尿病、高血壓、高脂血癥等疾病的頻發(fā)，重度肢體缺血（criticallimbischemia，CLI）發(fā)病率呈明顯升高趨勢，手術(shù)重建血流是保肢的重要方法，目前主流方法包括腔內(nèi)治療和旁路手術(shù)，但部分患者因全身情況差、遠(yuǎn)端流出道差，病因?qū)W等因素不適合，中遠(yuǎn)期療效差，6個月截肢率和死亡率分別高達(dá)40%和20%[1-2]。自體干細(xì)胞移植作為一種新興的血管再生技術(shù)，為這部分患者提供了一種新的治療方式[3]。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科自2009年5月起開展自體干細(xì)胞移植治療CLI以來[4-5]，共收治了14例經(jīng)常規(guī)血運(yùn)重建治療后無效的CLI患者，現(xiàn)對這部分患者的中期療效作回顧性分析。

表1 14例患者血運(yùn)重建治療史

資料與方法

一、一般資料

2009年5月至2015年12月共收治14例經(jīng)常規(guī)血運(yùn)重建治療后無效的CLI患者，均為男性，中位年齡（48±15）歲。其中血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitisobliterans，TAO）9例，下肢動脈硬化閉塞癥（atherosclerosis obliterans，ASO）3例，各種原因引起的動脈炎2例。所有患者術(shù)前均戒煙，并接受常規(guī)抗血小板、改善微循環(huán)藥物治療大于6個月。

14例患者除9號患者外，所有患者均有吸煙史，3例ASO患者均為老年男性，均合并高血壓，1例合并高脂血癥、冠狀動脈搭橋術(shù)后，1例曾有腦梗史。所有14例患者均有腔內(nèi)或開放手術(shù)治療史，術(shù)后癥狀均無明顯緩解或緩解后復(fù)發(fā)，甚至加重。14例患者治療史如表1所示。

其中6號患者曾經(jīng)接受4次常規(guī)血運(yùn)重建治療，每次均獲得緩解，但每次癥狀最終都會復(fù)發(fā)（表 2）。

14例患者中潰瘍6例，壞疽5例，單純靜息痛3例。初次血運(yùn)重建術(shù)前Rutherford分級：3級4例，4級3例，5級7例。其中7例患者術(shù)后缺血癥狀得到改善，其中療效維持大于1年的僅2例，剩余5例均于術(shù)后1年內(nèi)癥狀復(fù)發(fā)；另外7例患者治療后缺血癥狀無明顯改善或加重。干細(xì)胞治療前Rutherford分級：4級3例，5級11例。其中9例較初次治療前無改善，5例加重。

二、治療方案

具體方案既往已述[3-4]，概述如下：

1.人重組粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulatingfactor，G-CSF）動員 5 d，每天注射低分子肝素，監(jiān)測外周血白細(xì)胞計數(shù)；第5天進(jìn)行血漿分離（血漿分離機(jī)，德國Fresenius Hemocare公司），采集單個核細(xì)胞，采集物體積在200 ～ 300 ml，行白細(xì)胞計數(shù)與淋巴細(xì)胞分類，流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞純度；PBS緩沖液洗滌，調(diào)整體積至100 ～150 ml，得到外周血單個核細(xì)胞移植物。

2.加入CD34磁珠抗體（德國，MiltenyiBiotec GMBH公 司），應(yīng) 用 CliniMACS分 選 儀（德 國，MiltenyiBiotec GMBH公司）完成CD34+細(xì)胞純化分選，獲得純化移植物，體積約45 ml，其中40 ml用于細(xì)胞移植，其余進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)與分類，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞純度。

3.采用非純化方法進(jìn)行自體干細(xì)胞移植的患者，使用第一步所得到的產(chǎn)物進(jìn)行移植，采用純化方法的患者，使用第二步得到的產(chǎn)物進(jìn)行移植。

4.移植物分點(diǎn)肌肉注射，移植細(xì)胞總數(shù)1×105～1×106個/kg。

5.對伴有明顯感染的潰瘍、壞疽，移植術(shù)中1期清創(chuàng)和或截趾，若為干性壞疽，無伴發(fā)感染則留待2期處理；術(shù)后長期口服西洛他唑和拜阿司匹林。

三、質(zhì)量控制指標(biāo)

1.動員期間，每日行血常規(guī)及CD34+細(xì)胞計數(shù)，隨訪白細(xì)胞及CD34+細(xì)胞上升趨勢。

2.血漿分離采集產(chǎn)物，行血常規(guī)及CD34+細(xì)胞計數(shù)，以評估CD34+細(xì)胞數(shù)量是否足以完成移植并達(dá)到1×105～ 1×106/kg的劑量范圍。

3.對分選純化產(chǎn)物進(jìn)行血常規(guī)及CD34+細(xì)胞計數(shù)，以確認(rèn)CD34+細(xì)胞劑量是否達(dá)標(biāo)。

四、隨訪及觀測指標(biāo)

所有患者術(shù)后第1個月內(nèi)每周電話隨訪，記錄靜息痛緩解起始時間。術(shù)后第 1、2、3、6、9、12 個月時隨訪1次，之后每年隨訪1次。內(nèi)容包括：Wong-Baker FACES疼痛評分、無痛步行時間、潰瘍及壞疽愈合情況、眼底照相檢查。

五、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計分析。術(shù)后12個月保肢率使用Kaplan-Meier生存分析法分析，疼痛評分、無痛步行時間以表示，治療前后不同時間差異采用方差分析檢驗，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 6號患者接受干細(xì)胞移植前血運(yùn)重建治療經(jīng)過

結(jié) 果

一、質(zhì)量控制

所有患者動員5 d后，白細(xì)胞計數(shù)均＞ 40×109/L，CD34+細(xì)胞移植劑量均控制在 1×105～ 1×106/kg范圍內(nèi)。

二、不良反應(yīng)

動員期間，除惡心、腰痛、低熱等表現(xiàn)外，未觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)，且均于停止動員2 d內(nèi)恢復(fù)。行血漿分離采集時，8例患者出現(xiàn)口唇手腳發(fā)麻，予以口服1 ～ 2 g葡萄糖酸鈣后即獲緩解。圍手術(shù)期無死亡病例。14例患者均未發(fā)現(xiàn)眼底血管病理性增生。

三、隨訪結(jié)果

共計治療14條肢體，14例患者均完成隨訪，平均隨訪時間（42±25）個月（12 ～ 74 個月），無失訪病例，術(shù)后1年無死亡，術(shù)后2年死亡1例，術(shù)后2年總體生存率92.86%（13/14）。

使用Wong-Baker FACES疼痛評分量表對患者術(shù)前靜息痛程度進(jìn)行評估，14例患者干細(xì)胞移植術(shù)前術(shù)后平均疼痛評分，術(shù)后6個月及術(shù)后1年較術(shù)前改善均明顯（P ＜ 0.05，表 3）。

使用運(yùn)動平板，以2.5 km/h、10%坡度對患者術(shù)前平均無痛步行時間進(jìn)行評估，14例患者干細(xì)胞移植術(shù)前術(shù)后平均無痛步行時間，術(shù)后6個月及術(shù)后 1年較術(shù)前改善均明顯（P ＜ 0.05，表 3）。

術(shù)前共計6例患者合并潰瘍，均于術(shù)后1年內(nèi)全部愈合。術(shù)前合并壞疽患者共計5例，其中1例術(shù)后自行脫落，3例予以1期清創(chuàng)截趾，術(shù)后創(chuàng)面均愈合良好。10號患者壞疽愈合情況如圖1所示。1例術(shù)后靜息痛緩解不顯著，壞疽無愈合趨勢，患者無法耐受，于術(shù)后1個月行膝下截肢術(shù)。另有1例ASO患者術(shù)前單純靜息痛，因術(shù)后疼痛改善輕微，于術(shù)后3個月行膝上截肢術(shù)。14例患者術(shù)后1年共計2例截肢，使用Kaplan-Meier生存分析評估術(shù)后1年保肢率為86%（12/14），術(shù)后2年無截肢生存率78.57%（11/14）。

表3 14例重度肢體缺血患者手術(shù)前后Wong-Baker FACES疼痛評分及無痛步行時間比較

圖1 10號患者自體干細(xì)胞移植術(shù)前后患足照片

討 論

血管腔內(nèi)治療或旁路手術(shù)，是當(dāng)下針對CLI血運(yùn)重建治療的主流模式，但其對患者本身一般情況能否耐受手術(shù)創(chuàng)傷或血管解剖條件是否允許，具備相當(dāng)?shù)囊?，并且在有條件接受治療的患者中，中遠(yuǎn)期治療效果并不理想[6]。而對于接受常規(guī)血運(yùn)重建治療仍無法緩解缺血癥狀或術(shù)后短時間內(nèi)緩解，中遠(yuǎn)期缺血癥狀再次出現(xiàn)的患者，即便有條件再次接受常規(guī)血運(yùn)重建治療，中遠(yuǎn)期治療效果仍然不佳。本研究收錄的14例患者中，均曾接受常規(guī)血運(yùn)重建治療，但部分患者術(shù)后療效不明顯，或僅獲得術(shù)后短期內(nèi)緩解。更有5例患者，曾反復(fù)多次接受常規(guī)血運(yùn)重建，均未獲得理想療效。針對這一部分患者，缺乏一種中遠(yuǎn)期安全有效的血運(yùn)重建方法，因此其預(yù)后極不理想，該部分患者截肢率高達(dá)40%，6個月內(nèi)死亡率高達(dá)20%[7]。

干細(xì)胞療法，作為一種新型血運(yùn)重建方式，為這部分患者帶來了希望，提供了治療的可能性。Tateishi-Yuyama等[8]在2002年首次報道了使用自體外周血單個核細(xì)胞或骨髓單個核細(xì)胞移植治療CLI的前瞻性隨機(jī)對照研究，取得了令人滿意的療效，大部分患者靜息痛得到緩解，潰瘍愈合，并成功保肢。在此項里程碑式的研究之后，國內(nèi)外治療性血管再生療法治療CLI的研究不斷涌現(xiàn)，外周血或骨髓單個核細(xì)胞移植治療CLI的安全性和有效性得到了不斷驗證[9-12]。作為治療性血管再生療法的核心，移植物中內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量，是決定療效的關(guān)鍵。CD34是一種造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共同表面分子，通過使用CD34免疫磁珠純化，可獲得高純度的上述3種細(xì)胞的混合物，而造血干細(xì)胞在缺血環(huán)境下又可分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞并發(fā)揮血管再生作用[13-14]，因此純化CD34+細(xì)胞移植治療CLI，同樣安全有效[15]。

為分析干細(xì)胞移植對常規(guī)血運(yùn)重建治療失敗患者的療效，本研究使用外周血單個核細(xì)胞移植，或純化CD34+細(xì)胞移植的方法，對14例常規(guī)血運(yùn)重建失敗的CLI患者進(jìn)行了治療，大多數(shù)患者缺血癥狀明顯改善，靜息痛緩解，成功保肢，無痛步行時間明顯延長，不僅獲得了理想的預(yù)后，且生活質(zhì)量亦有所提高。除2例老年ASO患者靜息痛改善不明顯外，其余12例患者靜息痛均較術(shù)前改善顯著并維持至術(shù)后1年。在無痛步行時間方面，療效亦較為明確，個別患者術(shù)前無法步行，而術(shù)后所有14例患者均得到顯著改善。術(shù)前所有合并潰瘍的患者術(shù)后均愈合，術(shù)前合并壞疽患者也僅有一例未愈。缺血癥狀的顯著改善，使得保肢率大大提高，如此顯著的療效，對于曾反復(fù)多次接受常規(guī)血運(yùn)重建治療失敗的患者來說，顯得更有價值。

然而研究同時發(fā)現(xiàn)，本研究中3例老年ASO患者，其中2例結(jié)局不良。6號患者單純靜息痛，7號患者靜息痛合并壞疽，接受干細(xì)胞移植術(shù)后癥狀緩解不明顯，并分別于術(shù)后3個月和1個月截肢。由此可見，干細(xì)胞移植對老年ASO患者的療效，相比TAO患者較差。類似的，國外有研究曾報道了單個核細(xì)胞移植治療TAO和ASO的療效，有效率分別80%和50%[9-10,16]。究其原因，第一，引起內(nèi)皮功能異常的高危因素，如高齡、高血壓、糖尿病和高脂血癥，在老年ASO人群中更為常見；第二，高齡患者血漿中促血管生長因子含量下降較為明顯[7,17-19]。

綜上所述，自體干細(xì)胞移植可為常規(guī)血運(yùn)重建無效的CLI患者提供有效治療，且療效較持久，成功挽救肢體，改善生活質(zhì)量，為臨床治療這部分棘手患者，提供了新的選擇和可能。

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Autologous stem cell transplantation in the treatment of critical limb ischemia after failure of conventional revascularization

Fang Yuan1, Dong Zhihui1, Wei Zheng2, Fu Weiguo1, Pan Tianyue1,Gu Shiyang2, Chen Bin1, Guo Daqiao1, Xu Xin1, Liu Peng2, Jiang Junhao1, Yang Jue1.
1Department of Vascular Surgery,2Department of Hematology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Dong Zhihui, Email: dzh926@126.com

Peripheral vascular diseases; Ischemia; Stem cell transplantation;Transplantation, autologous

2016-09-17）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.003

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院人才培養(yǎng)計劃-優(yōu)秀骨干計劃（2015ZSYXGG02）

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科1，血液科2

董智慧，Email：dzh926@126.com

【Abstrat】ObjectiveTo evaluate the efficacy of autologous stem cell transplantation in the treatment of critical limb ischemia after failure of conventional revascularization.MethodsFrom May 2009 to November 2015, 14 patients with critical limb ischemia were enrolled and all of them had undergone conventional revascularization, including bypass surgery and stenting. The average age was 48±15 years（range, 21 ～ 75）. Conventional revascularization failed to improve ischemia in them. Apheresis was performed after 5-days' mobilization with GCSF to harvest stem cells. Stem cells were transplanted into the ischemic limb by intramuscular injection. Eleven patients were transplanted with purified CD34+cells and 3 patients with peripheral blood mononuclear cells.ResultsFollowup was accomplished in all 14 patients with an average follow-up time of（42±25）months（range 12 ～ 74）. During the follow-up there were 1 death and 2 major amputations which all occurred in aged patients with atherosclerosis obliterans. The overall survival rate 2 years after transplantation is 92.86%（13/14）and the amputation free survival rate is 78.57%（11/14）. The peak pain-freewalking time at 6 months was significantly improved from（3±2）minutes to（12±8）minutes（P ＜ 0.05,F = 14.95）and the Wong-Baker FACES pain rating score decreased from（7±1）to（1±1）（P ＜0.05, F = 18.00）.ConclusionsAutologous stem cell transplantation is safe and effective in treating critical limb ischemia after conventional revascularization failure.

方圓，董智慧，魏征，等.自體干細(xì)胞對常規(guī)血運(yùn)重建失敗的重度肢體缺血患者的療效觀察[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：136-140.