郭靖羅奇志田芳郭旭麗羅偉光鄒義洲

免疫磁珠分離淋巴細(xì)胞在流式交叉配型試驗中的應(yīng)用及研究

郭靖1,2羅奇志1田芳1郭旭麗1羅偉光1鄒義洲1

目的探討免疫磁珠快速分離法及密度梯度離心（Ficoll）分離法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC）在流式細(xì)胞交叉配型中的應(yīng)用比較。方法取10例交叉配型供體外周抗凝血各10 ml，受體非抗凝血5 ml，分別采用密度梯度離心與免疫磁珠陰性選擇試劑盒從相同體積的抗凝血中分離PBMC。用血細(xì)胞計數(shù)比較兩種方法分離的WBC、PLT、RBC粒度分布和PBMC中淋巴細(xì)胞的純度；用細(xì)胞流式和淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記熒光抗體檢測兩種方法分離得到的PBMC中T、B和NK細(xì)胞的數(shù)量質(zhì)量；將免疫磁珠陰性分離和密度梯度離心法分離的供者PBMC與受者血清共孵育，加入羊抗人IgG-FITC，洗滌后加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC單克隆抗體，再用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度。采用方差分析和t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果免疫磁珠陰性分離的PBMC數(shù)量是Ficoll分離PBMC的0.42倍，但淋巴細(xì)胞的比例[（99.2±0.08）%]高于PBMC分離的淋巴細(xì)胞比例[（82.5±5.27）%（t = 9.91，P ＜ 0.01）]，且兩種方法分離的PBMC 中 RBC 分別為（0.001±0.001）×106/μl和（0.02±0.009）×106/μl（t = 6.64，P ＜ 0.001）；血小板的數(shù)量分別為（1.00±0.05）×103/μl和（196.00±4.21）×103/μl差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t =146.46，P ＜ 0.01）。流式細(xì)胞檢測免疫磁珠分離的PBMC中CD3+T細(xì)胞為（81.33±4.60）%，CD19+B細(xì)胞為（8.41±0.87）%，CD3-CD56+NK細(xì)胞為（9.35±0.67）%和CD3+CD56+NKT細(xì)胞為（2.47±0.07）%。而Ficoll分離的PBMC中CD3+T細(xì)胞為（37.36±3.27）%，CD19+B細(xì)胞為（5.79±0.94）%，CD56+NK細(xì)胞為（6.60±0.91）%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 24.64、6.470、7.70、51.31，P均＜ 0.01）。T和B淋巴細(xì)胞流式交叉配型試驗中，設(shè)門定量讀取T和B淋巴細(xì)胞與受者血清中抗體結(jié)合情況，密度梯度離心獲得的淋巴細(xì)胞中混有血小板等，使流式檢測結(jié)果中會混有假陰性，而免疫磁珠分離法沒有出現(xiàn)假陰性結(jié)果。證明免疫磁珠分離的PBMC可應(yīng)用于臨床交叉配型試驗。結(jié)論免疫磁珠陰性選擇分離全血PBMC，用時短，純度高，去除了99%的血小板，不混有紅細(xì)胞、血小板，是一種優(yōu)于Ficoll分離PBMC的新方法。

外周血； 單核細(xì)胞； 離心法，梯密度； 免疫磁珠分離； 組織相容性試驗

外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）即外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是臨床和科研中研究與免疫學(xué)功能相關(guān)的重要免疫細(xì)胞。很多醫(yī)院開展淋巴細(xì)胞表型檢測、器官移植中的淋巴細(xì)胞交叉配型、科研中某種單核細(xì)胞的培養(yǎng)和人體DNA的抽提等，大都需要先從外周血分離PBMC。目前主要的分離方法有Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度離心法（Ficoll），其原理是不同種類細(xì)胞顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶[1-2]。該方法分離的單個核細(xì)胞成分混雜，常含有一些血小板與紅細(xì)胞。如要獲得純度更高的PBMC，可采用EasySep免疫磁珠陰性選擇分離方法。其原理是用多種非淋巴細(xì)胞單克隆抗體，與微小免疫磁珠一起加入全血中，吸附不需要的紅細(xì)胞、血小板和非淋巴細(xì)胞等，分離出未被磁珠吸附的淋巴細(xì)胞。本研究是應(yīng)用新的淋巴細(xì)胞快速分離方法獲取PBMC，分析其分離效果，并試用于臨床器官移植前的流式交叉配型試驗。

材料與方法

一、材料

1.樣品：腎臟移植手術(shù)腎臟供者外周血10 ml，分裝成兩管，肝素抗凝，室溫保存?zhèn)溆?。受者非抗凝? ml，對10例交叉配型試驗與傳統(tǒng)分離法進(jìn)行了對比分析。

2.主要儀器：高速臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），血球計數(shù)板（美國 Hausser scienti fi c公司），50 ml離心管（美國Corning 公司），Mini-MACS磁性吸附性分離裝置、MS吸附柱（德國Miltenyi Biotec 公司），全自動血細(xì)胞分析儀（美國Bechman公司）。

3.主要試劑 ：Ficoll-Hypaque分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司），肝素鈉注射液（天津生物化學(xué)制藥有限公司），EasySep Direct Human Total lymphocyte Isolation kit（美 國 Stemcell公 司）免疫磁珠緩沖液（德國Miltenyi Biotec公司），鼠抗人CD3-PE單抗、鼠抗人CD19-APC單抗、鼠抗人CD56-FITC流式單抗、鼠抗人IgG-FITC（美國BD公司）。

二、方法

（一）Ficoll分離PBMC

在15 ml離心管中加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll；取5 ml抗凝外周血與5 ml無菌RPMI-1640按照1：1充分混勻，用移液管沿管壁緩慢疊加于分層液面上；500×g水平離心20 min；離心后管內(nèi)分為3層，用移液器插到云霧層，吸取單個核細(xì)胞至另一15 ml離心管中，加入3倍以上體積的PBS，300×g離心10 min，洗滌細(xì)胞2次；末次離心后，棄上清液，細(xì)胞計數(shù)，用10%人血清PRMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至1×106/ml.

（二）免疫磁珠陰性選擇分離PBMC

按照人總淋巴細(xì)胞直接分離試劑盒（EasySepTM）的步驟說明操作，將1 ml×5新鮮肝素抗凝全血加入5 ml的圓底聚苯乙烯管，依次加入50 μl Isolation Cocktail和 50 μl RapidSpheresTM，混勻后室溫孵育5 min；加入PBS至終體積為2.5 ml，輕輕吹打2 ～ 3次使其混勻；將不帶蓋的聚苯乙烯管放入磁極，室溫孵育5 min，在不拿出磁極的情況下，混旋細(xì)胞懸液并倒入新的聚苯乙烯管，將收集的細(xì)胞懸液加入再加入50 μl RapidSpheresTM進(jìn)行二次分離，獲得的細(xì)胞懸液約2 ml，可進(jìn)行下一步實驗。

（三）全自動血細(xì)胞分析儀對PBMC的分析

將全血、密度梯度離心收集的PBMC和EasySep負(fù)性選擇分離的PBMC，按分離前全血的用量調(diào)整細(xì)胞檢測的濃度。各取50 μl用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。

（四）流式細(xì)胞術(shù)分析PBMC細(xì)胞中淋巴細(xì)胞比例

將上述兩種方法收集的PBMC各100 μl，抗凝全血100 μl，分別裝在2個試管中，分別加入鼠抗人CD19-APC流式單抗和鼠抗人CD3-PE流式單抗；CD3-PE 和 CD56-FITC 流式單抗各 20 μl。4 ℃孵育 30 min；PBS洗 3次，用 500 μl PBS重懸后，流式細(xì)胞儀分析。

（五）流式細(xì)胞儀交叉配型

將供者外周血按兩種不同方法分離的PBMC分別制成濃度為1×106/ml的混懸液，將混懸液100 μl分別裝在3個試管中，離心，去上清液。分別加入50 μl用10%人血清RPMI-1640按1：5稀釋的陰性對照、陽性對照和患者血清。混勻后置4 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次，加入鼠抗人IgG-FITC，4 ℃避光孵育30 min后，分別加入PBS洗滌3次，加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC單克隆抗體，4 ℃孵育10 min，再次洗滌；然后將細(xì)胞用500 μl PBS重懸后，用流式細(xì)胞儀3個顏色通道進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

表1 血細(xì)胞自動分析儀檢測不同方法分離的PBMC純度

結(jié) 果

一、免疫磁珠法與Ficoll法分離PBMC細(xì)胞分類計數(shù)

取相同體積經(jīng)EasySep和Ficoll分離獲得的PBMC，與抗凝全血用分析儀進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)。用Ficoll和Easy Sep法分離PBMC與原全血樣本的血細(xì)胞計數(shù)粒度分布如圖1所示：最明顯的效果是用Easy Sep方法分離的PBMC中幾乎不混有血小板，而且含有紅細(xì)胞的比例也顯著減少。表1列出了血細(xì)胞計數(shù)的具體數(shù)據(jù)。盡管EasySep方法在分離PBMC的過程中丟失了58%的WBC，但PBMC中含有淋巴細(xì)胞（LY）的比例從全血中的（37.7±1.46）%、Ficoll的（82.5±5.27）%提高至（99.2±0.08）%，三者之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其他細(xì)胞如紅細(xì)胞（RBC）和血小板（PLT）的數(shù)量在EasySep分離的PBMC中接近于0，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于Ficoll分離的紅細(xì)胞（0.02±0.009）×106/μl和血小板（196±4.21）×103/μl，兩組數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（表1）

二、免疫磁珠陰性分離PBMC的流式細(xì)胞表型檢測

圖1 全血、密度梯度離心與Easy Sep分離的PBMC中白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板粒度分布

圖2 外周血PBMC流式細(xì)胞表型測定

將10份血液樣本的全血、Ficoll密度梯度離心分離的PBMC和EasySep陰性選擇分離的PBMC進(jìn)行CD3-PE和CD19-APC雙染，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析（圖2），展示樣本-1的結(jié)果：從細(xì)胞SSC-FSC散點圖可以看出，EasySep免疫磁珠陰性選擇出來的PBMC比Ficoll分離的PBMC純度要好很多。95%以上的細(xì)胞包含在所設(shè)的門中。分離得到的PBMC含有（81.33±4.60）%的 CD3+T細(xì)胞，（8.41±0.87）%的CD19+B細(xì)胞和（9.35±0.67）%的CD3-CD56+NK細(xì)胞，CD3+CD56+NKT細(xì)胞含量比例為（2.47±0.07）%（如圖 2h、i）；Ficoll密度梯度離心獲得的PBMC中淋巴細(xì)胞的含量有所降低（如圖 2e、f），CD3+T 細(xì)胞為（37.36±3.27）%，CD19+B 細(xì)胞為（5.79±0.94）%，CD56+NK細(xì)胞為（6.60±0.91）%。提示后者PBMC中混有大量的非淋巴細(xì)胞。綜合流式檢測結(jié)果：EasySpe免疫磁珠分離供者的PBMC占分離細(xì)胞總數(shù)95%，顯著性高于Ficoll分離法（95.8%± 2.8%vs 20.3% ±6.8%，P ＜ 0.01）。（表 2）

表2 兩種方法分離的PBMC中淋巴細(xì)胞比例（%）

三、T和B淋巴細(xì)胞流式交叉配型

臨床腎移植手術(shù)前需要做配型試驗，即用供者血液中或脾、淋巴結(jié)組織中分離的淋巴細(xì)胞與受者血清進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。T和B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)有HLA-I類抗原分子，B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)有HLA-II類抗原分子。圖3是選取10例樣本中流式交叉配型中的一例：用供者外周血分離的PBMC與受者血清進(jìn)行的流式細(xì)胞交叉反應(yīng)。T細(xì)胞由CD3-PE標(biāo)記，B細(xì)胞由CD19-APC標(biāo)記，在流式點圖中設(shè)門。如果供者T和B細(xì)胞與受者血清中可能存在抗供者特異HLA-I類抗體結(jié)合，接下來加入的鼠抗人IgG-熒光標(biāo)記的二抗則能顯示出來，并根據(jù)細(xì)胞表面熒光的亮度進(jìn)行定量分析。圖3a、b、e、f為EasySpe 免疫磁珠分離供者的PBMC，供者T和B淋巴細(xì)胞與受者血清中的抗體反應(yīng)均呈現(xiàn)流式交叉配型陽性反應(yīng)。圖3c、d為Ficoll分離同一供者PBMC，其T和B淋巴細(xì)胞與相同受者血清中的抗體反應(yīng)呈現(xiàn)流式交叉配型陽性反應(yīng)。圖3c、d、g、h中有大量的血小板和紅細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞分群并不是特別明顯，會影響流式實驗中門的設(shè)置，對檢測結(jié)果有一定的影響。其他9例的T、B淋巴細(xì)胞流式交叉配型方法與上述方法一致。所有的交叉配型流式檢測結(jié)果顯示：應(yīng)用EasySpe法分離獲得的PBMC在進(jìn)行流式交叉配型試驗中，T、B淋巴細(xì)胞分群清晰，無血小板的影響，設(shè)門準(zhǔn)確，實驗結(jié)果具有更高實驗穩(wěn)定性。

討 論

分離PBMC是現(xiàn)今臨床與科研中的一項常規(guī)項目，F(xiàn)icoll作為傳統(tǒng)分離單個核細(xì)胞的方法其操作相對簡便與價格實惠而一直備受青睞。理想狀態(tài)下，F(xiàn)icolll離心法獲取單個核細(xì)胞的得率為80%～ 90% ，細(xì)胞純度90%以上[4-5]。但實際操作中，由于實驗室設(shè)備、環(huán)境因素及實驗操作人員的原因，分離效果往往未能達(dá)到理想標(biāo)準(zhǔn)。特別是在臨床組織配型實驗室的操作過程中很難從全血中獲得紅細(xì)胞和血小板污染較少的PBMC，而混有大量的血小板的PBMC，對待測血清樣本中HLA-Ⅰ類抗體具有吸附作用，吸附嚴(yán)重時可能導(dǎo)致交叉配型假陰性結(jié)果。另外由于Ficoll離心后取的細(xì)胞還需要洗滌幾次，實驗時間過長，這給臨床需要4 h內(nèi)做出器官移植交叉配型結(jié)果帶來困難。因此，尋找一種直接從全血中快速分離高純度的PBMC的分離方法十分必要。

Easy Sep分離法是最新的一種分離方法。其原理是將抗紅細(xì)胞、血小板、除淋巴細(xì)胞以外的血細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體制成免疫磁珠，這些混合的免疫磁珠直接加入到全血中進(jìn)行細(xì)胞吸附，未吸附的淋巴細(xì)胞可從磁場中分離洗脫出來，即為陰性選擇獲得的PBMC。其最少可以從0.5 ～ 1.5 ml的抗凝全血中分離到純度高（96%）的PBMC，這其中的淋巴細(xì)胞可達(dá)99%以上，可除掉99.9%的紅細(xì)胞，并且不含有血小板。在分離過程中不需與其他物品接觸，減少了污染，操作簡單，費時少。在科研及臨床實驗室其應(yīng)用前景十分廣范。

臨床器官移植，特別是腎移植之前需要用供者的淋巴細(xì)胞與受體血清混合進(jìn)行交叉配型試驗，以排除產(chǎn)生超急性體液排斥反應(yīng)的可能。傳統(tǒng)的方法是用Ficoll分離的方法將供者全血中的PBMC分離出來，再進(jìn)行交叉配型。PBMC的分離需要2 h。最大的問題在于Ficoll分離的PBMC中混有大量的血小板。由于血小板中含有HLA-Ⅰ類的抗原分子，大量的血小板吸附受者血清中可能存在的抗供者HLA-Ⅰ類分子的抗體，進(jìn)而影響T和B淋巴細(xì)胞流式交叉配型的結(jié)果。在臨床實驗中，常需對分離的PBMC進(jìn)行去紅細(xì)胞和血小板的處理，但會丟失淋巴細(xì)胞。

近幾年來，免疫磁珠陰性選擇分離全血PBMC，不僅使獲得PBMC的時間縮短至20 min以內(nèi)，而且解決Ficoll分離PBMC混有大量血小板和紅細(xì)胞的問題。為提高器官移植T和B淋巴細(xì)胞流式交叉配型的實驗結(jié)果質(zhì)量提供了一種新方法，具有重要的推廣價值。

1 郝素珍, 王桂琴. 實用醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M] .北京：高等教育出版社,2005：178

2 羅利瓊, 陳誠華, 張軍. 長期培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞的簡易分離純化方法[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2013, 30(4)：249-250.

3 Andy Kokaji, C Sun, G MacDonald, et al. Human regulatory T cell isolation in 55 minutes using EasySep? Releasable RapidSpheres?(TECH2P.912)[J]. The Journal of Immunology, 2015, 194：206.22

4 蔡敏敏, 顧曉瓊, 高飛, 等. 分離外周血單個核細(xì)胞的條件優(yōu)化[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 1(37)：1-5.

5 周文玲, 郝一文. 三種不同型號的血細(xì)胞分離機(jī)在采集外周血單個核細(xì)胞中的應(yīng)用分析[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志, 2014, 22(10)：1103-1108.

A new approach of rapidly isolating lymphocytes from whole blood with immune magnetic beads for organ transplant flow cytometry cross-matching

Guo Jing1,2, Luo Qizhi1, Tian Fang1,Guo Xuli1, Luo Weiguang1, Zou Yizhou1.
1Department of Immunology, School of Basic Medical Science, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410008, China;2Department of Immunology, School of Medicine, Ji Shou University, Jishou 416000, China

Zou Yizhou, Email: zouyizhou@hotmail.com

ObjectiveTo compare immunomagnetic bead and density gradient centrifugation（Ficoll）for the separation of peripheral blood mononuclear cells（PBMC）in flow crossmatching. Method Hemocytometer was used to count and compare the numbers of WBC,PLT, RBC isolated. For quality and quantity analysis of isolated T, B and NK cells in PBMC, flow cytometry was used to detect lymphocyte surface markers by specific fluorescent antibodies. Thedonor PBMC was used to detect antibodies in the recipient serum. Anti-human CD3-PE and antihuman CD19-APC monoclonal antibody were used for identification of T and B cells. Statistical analysis was performed using variance analysis and t test.ResultThe number of PBMC Macs separation is 0.42 times the Ficoll separation of PBMC, but the proportion of lymphocytes（99.2±0.08）%higher than that of PBMC isolated lymphocyte ratio（82.5 ± 5.27）%（t = 9.91, P ＜ 0.01）,and two methods of separating PBMC RBC respectively（0.001 ± 0.001）× 106/μl and（0.02 ± 0.009）×106/μl（t = 6.64, P ＜ 0.001）; the number of platelets were（1.00 ± 0.05）× 103/μl and（196.00 ± 4.21）×103/μl had statistical significance difference（t = 146.46, P ＜ 0.01）. Flow cytometry showed that CD3+T cells in PBMCs isolated from immunomagnetic beads were（8.41 ± 0.87）%, CD3-CD56+NK cell（9.35 ± 0.67）% and（2.47 ± 0.07）% of CD3+CD56+NKT cells. Ficoll isolated PBMCs contain（37.36 ± 3.27）% CD3+T cells,（5.79 ± 0.94）% CD19+B cells and（6.60 ± 0.91）% CD56+NK cells, and the differences were statistically significant（t = 24.64, 6.470, 7.70, 51.31, P ＜ 0.01）. In the cross matching test of T and B lymphocytes, quantitative read T and B lymphocytes and the serum antibody binding were tested. As density gradient centrifugation in lymphocyte mixed with platelets,so the flow cytometry results will be mixed with false negative, but the immune magnetic beads separation does not appear false negative results. It is proved that immunomagnetic separation PBMC can be used in clinical cross matching test.ConclusionPBMC isolated with immunomagnetic bead could yielded 99% pure lymophictes from whole blood with less contamination of RBC and platelets and may be used for T & B cell crossmatching in organ transplantation

Peripheral blood; Monocytes; Centrifugation, density gradient;Immunomagnetic bead separation; Histocompatibility testing

2016-05-23）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.005

國家自然科學(xué)基金面上項目（81571562）

410008 長沙，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系1；416000 吉首，湖南省吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室2

鄒義洲，Email：zouyizhou@hotmail.com

郭靖，羅奇志，田芳，等.免疫磁珠分離淋巴細(xì)胞在流式交叉配型試驗中的應(yīng)用及研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：146-151.