王強(qiáng) 俞國慶 黃雅清 傅云泉 陳鑫 莊永澤

Indoxyl Sulfate誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究

王強(qiáng) 俞國慶 黃雅清 傅云泉 陳鑫 莊永澤

目的硫酸吲哚酚（IS）刺激永生化人腹膜間皮細(xì)胞株（HMrSV5）后，研究細(xì)胞是否發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT），同時(shí)探索轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）可能在其中的作用。方法體外培養(yǎng)HMrSV5，傳代后，隨機(jī)將人腹膜間皮細(xì)胞株分成以3組：對(duì)照組：加入4.25%腹膜透析液與培養(yǎng)液共培養(yǎng)；IS處理組：分別用含250 μmol/LIS、500 μmol/LIS、1 000 μmol/LIS濃度的培養(yǎng)液與4.25%腹膜透析液共培養(yǎng)；TGF-β1受體抑制劑組：用含2 μmol/L LY364947+IS的培養(yǎng)液與4.25%腹膜透析液共培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、4、12、24、48和72 h時(shí)間下，采用細(xì)胞免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，Western Blot法研究細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)規(guī)律，48 h時(shí)用ELISA法測定纖維連接蛋白（FN），層粘連蛋白（LN5）兩種基質(zhì)蛋白的分泌情況。結(jié)果（1）免疫熒光法顯示：與正常細(xì)胞比較，IS處理組細(xì)胞由典型的鋪路樣鵝卵石狀，逐漸變細(xì)變長，呈梭形改變；而TGF-β1受體抑制劑組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，不如IS處理組；（2）Western Blot法檢測結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，IS處理組α-SMA的表達(dá)水平明顯增加，48 h 時(shí) 1 000 μmol/LIS 表達(dá)最明顯（39.929±2.610 vs 0.996±0.001 ；P ＜ 0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IS處理組比較，TGF-β1受體抑制劑組的表達(dá)則明顯減少，其中48 h時(shí)抑制明顯（7.418±3.075 vs 39.929±2.610，P ＜ 0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ；（3）ELISA 法結(jié)果顯示 ：與對(duì)照組比較，IS 處理組基質(zhì)蛋白 FN（1.368±0.040 vs 1.094±0.036，P ＜ 0.01）、LN5（1.031±0.085 vs 0.860±0.063，P ＜ 0.01）的表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IS處理組比較，TGF-β1受體抑制劑組 FN（0.925 ±0.15 vs 1.368 ±0.040，P ＜ 0.01）、LN5（0.795±0.426 vs 1.031±0.085，P ＜ 0.01）分泌均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IS可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT，TGF-β1的參與可能起重要作用，這為治療腹膜纖維化可能提供新的靶點(diǎn)。

腹膜間皮細(xì)胞； 硫酸吲哚酚； 細(xì)胞上皮-間充皮轉(zhuǎn)分化； 轉(zhuǎn)化生長因子β

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎臟病患者的一種替代治療。腹膜纖維化是導(dǎo)致腹透治療失敗的主要原因，而腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal-transition，EMT）就是其中主要的一種機(jī)制[1-3]。

近年來內(nèi)源性尿毒癥毒素的毒性作用日益得到重視，其中，第三類毒素硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）的研究最為廣泛，在慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者中IS的血清濃度比正常人顯著升高，它是一種蛋白結(jié)合毒素，由食物中的色氨酸代謝而來[4]，不容易被透析方式排出，對(duì)患者的腎臟及心血管系統(tǒng)均造成嚴(yán)重的影響[5]。文獻(xiàn)報(bào)道IS可以誘導(dǎo)近曲小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及成骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[6-8]，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、血管鈣化[7,9]以及血管老化[10]，可加快CKD的進(jìn)展[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，IS誘發(fā)小管上皮細(xì)胞EMT[12]。但I(xiàn)S能否誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，目前沒有見到相關(guān)研究。

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）是EMT過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，研究顯示腹膜間皮細(xì)胞在TGF-β1刺激下，α-SMA蛋白的表達(dá)和羥基脯氨酸的分泌增加，E-cadherin的表達(dá)下降，并且導(dǎo)致細(xì)胞失去了規(guī)則的立方形結(jié)構(gòu)，提示TGF-β1可以促進(jìn)α-SMA的表達(dá)[13]。

基于上述依據(jù)，本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究IS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的EMT作用以及TGF-β1可能在其中的作用，旨在通過明確IS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞EMT的影響機(jī)制，進(jìn)而對(duì)腹膜纖維化做出具有臨床意義的預(yù)防或治療措施。

材料與方法

一、材料

人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS液購自美國Hyclone公司，澳洲胎牛血清購自Gibco公司，4.5%腹透液購自廣東百特公司，TGF-β1受體抑制劑（LY364947）、硫酸吲哚酚（IS）購自美國 sigma公司，鼠抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）購自英國Abcam公司，纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）及層粘連蛋白（laminin5，LN5）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自美國RB公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇的HMrSV5細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后首次換液，以后48 h換液1次；待細(xì)胞生長達(dá)到80%～ 90%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代。細(xì)胞經(jīng)倒置相差顯微鏡、投射電鏡、掃描電鏡鑒定，細(xì)胞活力檢測：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9 ： 1混合混勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在3 min內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.實(shí)驗(yàn)分組：當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%～ 90%時(shí)，用0.25%胰酶消化，傳代后隨機(jī)分為3組：（1）對(duì)照組：加入4.25%腹透液與培養(yǎng)液共培養(yǎng)，培養(yǎng)中不予干預(yù)；（2）IS處理組：分別用含250 μmol/LIS、500 μmol/LIS、1 000 μmol/LIS 濃度的培養(yǎng)液與4.25%腹透液共培養(yǎng)；（3）TGF-β1受體抑制劑組：用含2 μmol/L LY364947+IS的培養(yǎng)液與4.25%腹透液共培養(yǎng)。分別孵育一定時(shí)間（0，4，12，24，48，72 h）后提取細(xì)胞總蛋白，其中ELISA在48 h提取上清液后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.免疫熒光化學(xué)檢測法觀察細(xì)胞形態(tài)變化：將培養(yǎng)的細(xì)胞傳至共聚焦皿中，加藥一定時(shí)間后，PBS漂洗充分，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次，每次3 min，山羊血清封閉30 min，加入適當(dāng)稀釋的鼠抗人 α-SMA 抗體（1：100），4 ℃過夜 ；PBS洗滌5次，每次3 min，加入非免疫山羊抗鼠IgG（1：200），37 ℃溫箱中孵育 1 h ；PBS 洗滌 5 次，每次3 min，DAPI染色5 min；洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，若有紅色熒光，可在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

4. Western Blot法研究細(xì)胞α-SMA的表達(dá)規(guī)律：收集細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷，PBS洗3遍，加入適量含蛋白酶抑制劑（PMSF）的 RIPA 裂解液（按 1：100）冰上充分裂解細(xì)胞，4 ℃，13 000×g離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度；按照1：4比例將5×SDS-PAGE與樣本混合，100 ℃變性10 min后，迅速置于冰上冷卻，13 000×g 離心 5 min，20 μl蛋白樣品行100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳（上層膠80 V，下層膠120 V），待電泳結(jié)束后，將切取下來的凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，并用5%脫脂奶粉封閉2 h。將膜放入稀釋的一抗溶液（鼠抗人α-SMA抗體）中，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次5 min，然后放入稀釋的二抗中，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，ECL試劑檢測蛋白表達(dá)。利用Western-blotting的照相軟件按照灰度值的高低來定量分析樣品中的蛋白表達(dá)，與內(nèi)參a-tublin的比值代表定量值。

5. ELISA法檢測FN及LN5的表達(dá)情況：將細(xì)胞種植于24孔板內(nèi)，提取上清液后并做好標(biāo)記后放置于-80 ℃內(nèi)凍存。用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 ～ 10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙稀板的反應(yīng)孔中加0.1 ml，37 ℃4 h。棄去孔內(nèi)溶液，用PBS洗3次，每次3 min。加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h，然后充分洗滌。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml，37 ℃孵育30 min，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml顯色，37 ℃10 min。于各反應(yīng)孔中加入終止液50 μl終止反應(yīng)。檢測吸光度（A）值，在檢測檢測儀上，于450 nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零后測各孔A值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照值的2.1倍，即為陽性。并將結(jié)果輸入電腦軟件進(jìn)行計(jì)算，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中FN及LN5的濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，圖片處理使用Photoshop。Western Blot及ELISA計(jì)量資料均采用±s表示，組間差異的比較運(yùn)用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布時(shí)用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. IS可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化：正常的HMrSV5細(xì)胞貼壁生長，排列緊密，呈典型的鋪路樣鵝卵石狀（圖 1），1 000 μmol/L IS 刺激細(xì)胞后，從12 h開始，共聚焦顯微鏡下可觀察細(xì)胞表達(dá)紅色熒光（圖2），熒光區(qū)域內(nèi)可見細(xì)胞變細(xì)變長，呈長梭形改變，以48 h變化最明顯，向典型的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。而1 000 μmol/LIS + LY364947刺激細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，從24 h開始出現(xiàn)紅色熒光（圖3），48 h可見部分細(xì)胞呈長梭形改變，但總體變化不如單純的 1 000 μumol/LIS 刺激，表示 TGF-β1受體抑制劑對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用明顯。

圖1 倒置顯微鏡下觀察正常腹膜間皮細(xì)胞株形態(tài)（×100）

2. IS刺激HMrSV5后，α-SMA表達(dá)量增加，而TGF-β1受體抑制劑可抑制其表達(dá)：Westernblotting法結(jié)果顯示：IS刺激細(xì)胞后，0 h、4 h條帶不明顯（圖4），從12 h開始，條帶逐漸變深，最大濃度1 000 μmol/LIS刺激細(xì)胞48 h后，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)量明顯增加，并達(dá)到最大值（P ＜0.05），提示細(xì)胞發(fā)生了EMT。同時(shí)用LY364947與1 000 μmol/LIS同時(shí)刺激細(xì)胞后，α-SMA表達(dá)量較 1 000 μmol/LIS 組明顯下降（P ＜ 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1），說明TGF-β1受體抑制劑對(duì)IS促進(jìn)HMrSV5轉(zhuǎn)分化具有抑制作用，提示TGF-β1在HMrSV5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中可能發(fā)揮著重要的作用。

圖2 共聚焦顯微鏡下觀察IS處理組HMrSV5細(xì)胞發(fā)形態(tài)（IF染色，×400）

圖3 共聚焦顯微鏡下觀察TGF-β1受體抑制劑組HMrSV5細(xì)胞形態(tài)（IF染色，×400）

3. IS刺激腹膜間皮細(xì)胞 48 h后FN、laminin 5的分泌均上調(diào)：IS刺激腹膜間皮細(xì)胞 48 h后，ELISA結(jié)果顯示：IS能促進(jìn)基質(zhì)蛋白FN、LN5的分泌，不同的是，當(dāng)IS濃度達(dá)1 000 μmol/L是，F(xiàn)N分泌最大（P ＜ 0.05），而 LN5 則是 500 μmol/L 達(dá)最大值（P ＜ 0.05，表 2），運(yùn)用 LY364947 作為通路抑制劑后，兩者的分泌均顯著降低（P ＜ 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 對(duì)照組、IS處理組及TGF-β1受體抑制劑組培養(yǎng)不同時(shí)間后灰度值比較（±s）

表1 對(duì)照組、IS處理組及TGF-β1受體抑制劑組培養(yǎng)不同時(shí)間后灰度值比較（±s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05 ；與 1 000 μmol/LIS 濃度組比，bP ＜ 0.05

分組 0 h 4 h 12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.012±0.001 1.115±0.116 1.066±0.114 1.034±0.066 0.996±0.001 1.115±0.116 250 μmol/LIS 1.035±0.305 2.358±0.310a2.725±0.310a2.151±0.355 0.873±0.419 25.025±2.332a500 μmol/LIS 1.245±0.202 3.491±0.328a4.079±0.189a4.744±0.199a1.831±0.505 36.491±2.227a1 000 μmol/LIS 1.176±0.316 2.518±0.180a5.317±0.275a 35.707±2.008a 39.929±2.610a 25.518±1.173aTGF-β1 受體抑制劑組 0.821±0.265 1.871±0.535b4.305±0.240b 14.738±2.364b7.418±3.075b1.871±0.535bF值 1.331 21.377 145.845 321.323 254.515 308.506 P 值 0.324 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖4 不同時(shí)間各組刺激細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白的條帶變化

表2 對(duì)照組、IS處理組及TGF-β1受體抑制劑組培養(yǎng)48 h后 LN5、FN 濃度（μg /L）比較（±s）

表2 對(duì)照組、IS處理組及TGF-β1受體抑制劑組培養(yǎng)48 h后 LN5、FN 濃度（μg /L）比較（±s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05 ；與 500 μmol/LIS 濃度組比，bP ＜ 0.05 ；與 1 000 μmol/LIS 濃度組比，cP ＜ 0.05

分組 FN LN-5對(duì)照組 1.094±0.036 0.860±0.063 250 μmol/LIS 1.077±0.038 0.829±0.085 500 μmol/LIS 1.225±0.035 1.031±0.085a1 000 μmol/LIS 1.368±0.040a 0.860±0.069 TGF-β1 受體抑制劑組 0.925±0.154c0.795±0.426bF值 14.053 7.146 P值 0.000 0.003

討 論

腹膜纖維化是導(dǎo)致腹透治療失敗的主要原因，研究腹膜纖維化的機(jī)制進(jìn)而尋找預(yù)防其發(fā)生的干預(yù)措施一直是近年來透析學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，腹膜間皮細(xì)胞的EMT就是其中主要的一種[1-2]。腹膜間皮細(xì)胞層在調(diào)節(jié)腹膜功能，抑制炎癥和纖維化中起著關(guān)鍵作用。研究顯示EMT過程中的間皮細(xì)胞表達(dá)某些促血管新生因子，比如VEGF等的表達(dá)增加，因而推測EMT、血管新生和腹膜纖維化相互作用，共同損傷腹膜[3]。因此，學(xué)者認(rèn)為腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT是腹膜纖維化的起始和可逆環(huán)節(jié)[14]，是主要機(jī)制之一。

多種原因可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT，例如腹透液的葡萄糖、氧化應(yīng)激產(chǎn)物等[15]。近年來內(nèi)源性尿毒癥毒素的毒性作用日益得到重視，此類毒素包含三類毒素：第一類是以尿素為代表的小分子毒素；第二類是以β2微球蛋白為代表的中大分子毒素，第三類就是蛋白結(jié)合毒素，以IS和phenolic compounds為代表。研究發(fā)現(xiàn)，腹膜透析患者血清IS水平顯著升高，而腹膜透析對(duì)其清除也顯著增加，但仍不足以代償腎功能下降[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)IS可顯著增加CKD患者死亡率[17]，但此類毒素與腹膜透析相關(guān)的研究則較少[18]。文獻(xiàn)報(bào)道IS可以誘導(dǎo)近曲小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及成骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[6-8]，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、血管鈣化[7,9]以及血管老化[10]，可加快CKD的進(jìn)展[11]。促進(jìn)單核細(xì)胞向前纖維化巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化[19]。它還可以增加TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)纖維化，加速5/6腎切除大鼠的腎功能惡化，提示IS對(duì)TGF-β1的作用[20]，而緩解IS過負(fù)荷則可以減少氧化應(yīng)激，改善5/6腎切除大鼠腎小管-間質(zhì)纖維化[21]。最近文獻(xiàn)報(bào)道，IS可以促進(jìn)近端小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，降低E-cadherin和zonula occludens-1表達(dá)，誘發(fā)小管上皮細(xì)胞EMT[12]。但I(xiàn)S能否誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，目前沒有見到相關(guān)研究。為此，本研究首先通過采用細(xì)胞免疫熒光法檢測IS作用下細(xì)胞的形態(tài)變化，并通過激光共聚焦，對(duì)樣本進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，獲得比熒光顯微鏡更清晰的圖片，通過任意角度旋轉(zhuǎn)，觀察細(xì)胞形態(tài)。發(fā)現(xiàn)IS刺激后，0 h、4 h細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，從12 h開始，顯微鏡下可見腹膜間皮細(xì)胞逐漸變細(xì)變長，呈長梭形改變，以48 h變化最明顯，呈典型的纖維細(xì)胞樣改變，同時(shí)，免疫熒光顯示α-SMA的表達(dá)增加，說明腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化。

此外，本研究還采用Western-blot方法證明IS促進(jìn)HMrSV5表達(dá)α-SMA的作用。結(jié)果顯示不同濃度IS刺激HMrSV5后，α-SMA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，但并非呈濃度依賴關(guān)系，分別在500 μmol/L和1 000 μmol/L表達(dá)最強(qiáng)。從時(shí)間上看，隨著刺激時(shí)間的延長，α-SMA的表達(dá)總體有增加，但并非呈時(shí)間依賴關(guān)系，在濃度為1 000 μmol/L刺激時(shí)間48 h達(dá)最高峰。出現(xiàn)非時(shí)間依賴性的因素考慮可能有（1）隨著時(shí)間的延長，IS不斷的消耗，濃度的下降對(duì)細(xì)胞的影響變?nèi)?；?）IS對(duì)細(xì)胞不斷的刺激之后，使細(xì)胞對(duì)IS毒素產(chǎn)生了一定的抵抗，可能引起細(xì)胞對(duì)毒素的耐受，毒性作用下降；（3）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，會(huì)使細(xì)胞變得密集，導(dǎo)致細(xì)胞與IS的有效接觸面積變小。總之，IS刺激HMrSV5可使α-SMA蛋白表達(dá)增加。

TGF-β1是致腹膜纖維化的重要因素。Margetts等[22]通過基因工程發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入TGF-β1的小鼠體內(nèi)與EMT及纖維化相關(guān)的基因表達(dá)明顯增多，如膠原I、α-SMA，并在間皮細(xì)胞下組織發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞角蛋白和α-SMA陽性的成纖維細(xì)胞。為了明確TGF-β1在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用。結(jié)果也顯示，IS刺激HMrSV5后，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA與基質(zhì)蛋白FN、LN5分泌顯著增加，提示IS促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)分化，而加入TGF-β1受體抑制劑后，α-SMA表達(dá)、FN及LN5分泌顯著減少，提示TGF-β1可能參與IS誘導(dǎo)間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程。

基于上述結(jié)果，本研究表明IS可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT，而TGF-β1可能在其中起重要作用。而IS如何造成腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將是下一步研究內(nèi)容。

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Experimental study on epithelial-mesenchymal-transition of peritoneal mesothelial cells induced by indoxyl sulfate

Wang Qiang, Yu Guoqing, Huang Yaqing, Fu Yunquan, Chen Xin, Zhuang Yongze.
Department of nephrology, Fuzhou General Hospital, People's Liberation Army of China,Fuzhou 350025,China

Yu Guoqing, Email:yuguoqing@medmail.com.cn

ObjectiveTo induce epithelial mesenchymal transition（EMT）of immortalized human peritoneal mesothelial cell line（HMrSV5）with indoxyl sulfate (IS) and investigate the role of transforming growth factor（TGF-β1）.MethodsHMrSV5 cells were randomly divided into 3 groups： the control group： with 4.25%peritoneal dialysate fluid in culture medium; IS groups： with IS at final concentrations oft 250 μmol/L, 500 μmol/L, and 1 000 μmol/L and 4.25%peritoneal dialysate fluid; TGF-β1 inhibitor group： with 2 μmol/L LY364947, IS and 4.25%peritoneal dialysate fluid. At 0 h, 4 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 72 h, the morphological changeswere observed by immunofluorescence method, and alpha smooth muscle actin（α-SMA）expression was evaluated with Western Blot. At 48 h，supernatant was collected to determinate fibronectin and laminin5 by ELISA.ResultsAfter IS induction, cells change from typical cobblestone-like shape to long fusiform shape, which was prevented but TGF-β1 inhibitor. Western Blot showed that： compared with control group the expression level of α-SMA increased significantly in the IS treatment group.The level of α-SMA was highest at 48 h with 1 000 μmol/L IS（39.929±2.610 vs 0.996±0.001;P ＜ 0.05）, which was decrease to 7.418±3.075 in the presence of TGF-β1 inhibitor（P ＜ 0.05）.Compared with control group, IS increased the secretion of FN（1.368±0.040 vs 1.094±0.036, P ＜ 0.05）and laminin 5（1.031±0.085 vs 0.860±0.063, P ＜ 0.05）, which were decreased by TGF-β inhibitor（0.925±0.15 and 0.795±0.426 respectively, P ＜ 0.05）.ConclusionEMT of PMC could be induced by IS via TGF-β1 signaling pathway and is potential target for the treatment of peritoneal fibrosis.

Peritoneum; Stromal cells; Sulfuric acids; Indophenol; Epithelialmesenchymal-transition; Transforming growth factor beta

2017-03-07）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.006

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014J01426）

350025 福州，中國人民解放軍福州總醫(yī)院腎內(nèi)科

俞國慶，Email：yuguoqing@medmail.com.cn

王強(qiáng)，俞國慶，黃雅清，等. Indoxyl Sulfate誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：152-158.