李群英何清華徐 露李 靖

（1.四川省遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401520）

·研究報(bào)告·

辣椒素對(duì)腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制探討*

李群英1何清華1徐 露2李 靖3△

（1.四川省遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401520）

目的 觀察辣椒素對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法 將75只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、辣椒素高劑量組、辣椒素中劑量組和辣椒素低劑量組，每組15只。除空白組外，線栓法建立大鼠右腦缺血再灌注模型。辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低劑量組分別灌胃辣椒素100、50、25 mg/（kg·d），其他兩組灌胃相應(yīng)劑量的CMC-Na溶液，連續(xù)7 d。隨后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、干濕重法檢測(cè)大鼠腦含水量、TUNEL法測(cè)定神經(jīng)元的凋亡、Western blot法測(cè)定cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低劑量組均顯著降低了神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、神經(jīng)元凋亡數(shù)量和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論 辣椒素對(duì)腦缺血再灌注有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注 辣椒素 cleaved Caspase-3

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血后發(fā)生細(xì)胞損傷，但恢復(fù)血供后損傷反而加重的現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷是3大致死疾病之一，其致殘致死率逐年上升，嚴(yán)重危害著公眾的健康。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的主要機(jī)制之一，如何抑制神經(jīng)元的凋亡，是治療藥物開(kāi)發(fā)的重要方向［1］。辣椒素（CAP）是辣椒中引起辣味的物質(zhì)，分子式為C18H27NO3。藥理學(xué)研究證實(shí)，辣椒素具有鎮(zhèn)痛、調(diào)血脂、保護(hù)胃黏膜、抗癌等作用；研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素能有效抑制缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞凋亡［2-3］。辣椒素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能否發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用目前尚無(wú)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)將觀察辣椒素對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：2007.0001，SPF級(jí)飼養(yǎng)條件。

1.2 藥物與試劑 辣椒素購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司（批號(hào)20141012，純度＞98%），將其溶于0.5%的CMC-Na溶液中，配制成50 mg/mL的混懸液。TUNEL試劑盒和cleaved Caspase-3抗體，購(gòu)自Abcam公司。

1.3 模型制備 根據(jù)Longa的方法，建立腦缺血再灌注大鼠模型［4］。10%水合氯醛以350 mg/kg的劑量腹腔注射用以麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠固定于鼠板上，于頸正中切開(kāi)皮膚，分離出右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）與頸外動(dòng)脈（ECA），于Y型分枝下3 cm處結(jié)扎ECA，于ECA上剪一“V”型小口，再將長(zhǎng)度為20 mm的魚(yú)線經(jīng)ECA插進(jìn)ICA，深度約（18.50±0.50）mm，從而阻斷MCA血供。缺血時(shí)間為2 h，2 h后再將魚(yú)線輕輕拔出，實(shí)現(xiàn)再灌。建立好的腦缺血再灌注損傷大鼠模型經(jīng)Longa的神經(jīng)評(píng)分法評(píng)分，分?jǐn)?shù)＞3分的納入實(shí)驗(yàn)［4］。

1.4 分組與給藥 75只健康成年雄性SD大鼠，分為空白組、模型組、辣椒素高劑量組、辣椒素中劑量組和辣椒素低劑量組，每組15只?？瞻捉M不進(jìn)行任何手術(shù)處理，其余各組用線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型。辣椒素高、中和低劑量組分別灌胃100、50和25 mg/kg的辣椒素，空白及模型組灌胃相應(yīng)劑量的CMC-Na溶液，每日1次。連續(xù)7 d。

1.5 觀察指標(biāo) 1）神經(jīng)功能評(píng)分：各組大鼠于末次給藥后，根據(jù)Longa 5分法對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。無(wú)神經(jīng)缺損，為0分；提鼠尾左前爪內(nèi)收，且無(wú)法伸直，為1分；行走左傾，為2分；左旋轉(zhuǎn)，為3分；昏迷或無(wú)法行走，為4分。2）腦含水量檢測(cè)：腦含水量檢測(cè)方法為干濕重法，每組抽取大鼠5只。經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后斷頭取腦，去除嗅球、小腦與低位腦干，分離左右腦半球，迅速稱質(zhì)量，所得質(zhì)量為濕質(zhì)量。隨后放入110℃電烤箱進(jìn)行烘烤，時(shí)間為24 h，取出迅速稱質(zhì)量，所得質(zhì)量為干質(zhì)量。腦含水量（%）＝（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。3）TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡：每組抽取大鼠5只，用水合氯醛進(jìn)行麻醉，再仰臥固定于鼠板，在胸腹處進(jìn)行聯(lián)合切口再暴露出心臟。右心耳剪一缺口，將灌注針從心尖插入左心室，先灌入500 mL生理鹽水，沖干血液，再灌入4℃的40 g/L濃度的多聚甲醛緩沖液，固定。斷頭取腦，常規(guī)固定2 h，洗滌4 h，再梯度乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋，再切厚度為5 μm的切片。其余步驟嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。光鏡下觀察，有棕黃色顆粒細(xì)胞核的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，算作凋亡細(xì)胞。每張切片在400倍光鏡下，選取海馬CA1區(qū)獨(dú)立的4個(gè)視野區(qū)，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算出TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)。4）cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)：每組隨機(jī)選取5只大鼠，提取出腦組織蛋白。先以BCA法檢測(cè)出蛋白含量，再將生理鹽水稀釋組織勻漿上清液至2000 μg/mL。加入4倍上樣緩沖液，于沸水中進(jìn)行5 min水浴，再于-40℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取?0 μL樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒壓設(shè)為80 V，電泳時(shí)間為30 min，再設(shè)為120 V，至電泳結(jié)束，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。于200 mA下轉(zhuǎn)膜1 h，再于室溫下封閉液進(jìn)行PVDF膜的封閉，過(guò)夜。剪下PVDF膜，加入1∶250cleaved Caspase-3、β-actin一抗，再在室溫下孵育1 h，TBST漂洗3次，每次為5 min。隨后加入1∶5000二抗，室溫孵育45 min。TBST漂洗3次，5 min。ECL法顯色，于暗室中曝光2 min，再顯影定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 見(jiàn)表1。結(jié)果示腦缺血再灌注后，模型組及辣椒素高、中、低劑量組動(dòng)物均發(fā)生明顯的神經(jīng)功能損害。與模型組相比，辣椒素高、中和低劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量比較（±s）

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。下同。

組 別 n 神經(jīng)功能評(píng)分（分） 腦含水量（%）空白組 15 0.0±0.0 77.62±0.18模型組 15 3.67±0.51 83.47±0.47辣椒素高劑量組 15 2.32±0.31*80.22±0.33*辣椒素中劑量組 15 2.44±0.46*80.64±0.37*辣椒素低劑量組 15 2.36±0.43*80.75±0.40*

2.2 各組大鼠腦含水量檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表1。腦含水量結(jié)果表明，腦缺血再灌注后，模型組和辣椒素高、中、低劑量組動(dòng)物的腦含水量均出現(xiàn)明顯升高。與模型組相比，辣椒素高、中和低劑量組腦含水量顯著下降（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果比較 見(jiàn)表2。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞是細(xì)胞核內(nèi)黃色顆粒的細(xì)胞。結(jié)果表明，腦缺血再灌注后，模型組和辣椒素高、中、低劑量組動(dòng)物的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)明顯上升，與空白組有顯著差異（P＜0.05）。與模型組比較，辣椒素高、中和低劑量組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下降（P＜0.01）。

表2 各組海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量空白組 15 1.97±0.72 0.36±0.08模型組 15 10.63±2.98 0.89±0.07辣椒素高劑量組 15 4.25±1.26*0.52±0.05*辣椒素中劑量組 15 4.03±1.20*0.55±0.04*辣椒素低劑量組 15 3.79±1.15*0.61±0.06*

2.4 各組大鼠cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)比較見(jiàn)圖1，表2。Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、辣椒素高、中和低劑量組動(dòng)物的cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯的升高。與模型組相比，辣椒素高、中和低劑量組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

隨著我國(guó)人口老齡化，腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。腦缺血再灌注損傷在腦血管疾病中占有極大的比例，而目前臨床上沒(méi)有針對(duì)該損傷的有效藥物，亟需開(kāi)發(fā)出新的有效藥［5］。辣椒（Capsicum annuum L.syn.c.frutescans）是屬于茄科辣椒屬植物，其主要辛辣成分為辣椒素，是含香草酰胺的生物堿［6］。目前，針對(duì)辣椒素的藥理作用已經(jīng)進(jìn)行了很多研究，已發(fā)現(xiàn)辣椒素具有治療消化性潰瘍、預(yù)防心血管疾病、治療咳嗽、感冒、抗癌等作用［7］。

腦缺血再灌注發(fā)生后，炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)興奮性毒性都會(huì)引起腦組織損傷。其中腦細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡，即細(xì)胞凋亡，造成了一系列神經(jīng)功能障礙［8］。Caspase家族是哺乳類動(dòng)物凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者。在Caspase家族中，有一種關(guān)鍵的酶，叫做Caspase-3，它是最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者［9-10］。前期研究表明，缺血缺氧損傷中引起神經(jīng)元凋亡的主要通路就是由Caspase參與的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［11］。正常情況下，Caspase-3以酶原的形式存在，在各組水解酶的作用下，其裂解后發(fā)生活化，活化的Caspase-3通過(guò)自催化，再次裂解為cleaved Caspase-3。cleaved Caspase-3是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，是目前已知的執(zhí)行凋亡的最后因子［12-14］。cleaved Caspase-3使得DNA發(fā)生結(jié)構(gòu)性斷裂，從而使得細(xì)胞發(fā)生凋亡［15-16］。

通過(guò)建立腦缺血再灌注大鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)辣椒素能能顯著降低神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、神經(jīng)元凋亡數(shù)量和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，說(shuō)明辣椒素對(duì)腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡，減輕腦損傷。

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Effect of Capsaicin on the Rat Model of Cerebral Focal Ischemia with Reperfusion and its Mechanism

LI Qunying，HE Qinghua，XU Lu，et al.SuiNing City Central Hospital，Sichuan，Suining 629000，China.

Objective：To study the effects of capsaicin on rats of cerebral focal ischemia with reperfusion and its mechanism.Methods：75 SD rats were randomly divided into 5 groups：control group，model group，cap high dose，cap middle dose and cap low dose group with 15 rats in each group.The suture method was used to establish the model of MCAO-reperfusion except the control group.Cap high dose，cap middle dose and cap low dose group were given 100，50 and 25 mg/kg cap for consecutive 7 days.Neurological deficit was scored，brain water content was detected with dry-wet method，neuronal apoptosis was measured with TUNEL method and level of cleaved caspase-3 were detected with western blot method.Results：Neurological deficit testing scores，brain water content，neuronal apoptosis and the level of cleaved caspase-3 decreased significantly in cap high dose，cap middle dose and cap low dose group（P＜0.01）and the difference was statistically significant compared the control group.Conclusion：Capsaicin has a protective effect on the rats of cerebral focal ischemia with reperfusion，and its mechanism may be related to reducing the expression of cleaved Caspase-3 protein.

MCAO；Capsaicin；Cleaved Caspase-3

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0797-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.013

2017-02-07）

重慶市科委基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目（cstc2016jcyA0268）

△通信作者（電子郵箱：lijing1976@163.com）