劉雅琳， 周 艷， 耿盼盼， 解裕萍， 喬洪圖， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650118)

恒河猴miR-125a-3p慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定以及功能研究

劉雅琳， 周 艷， 耿盼盼， 解裕萍， 喬洪圖， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650118)

構(gòu)建攜帶miR-125a-3p過表達(dá)與抑制表達(dá)shRNA的慢病毒，研究miR-125a-3p對輪狀病毒感染乳鼠導(dǎo)致的腹瀉的影響，為進(jìn)一步研究miR-125a-3p對輪狀病毒增殖過程中的影響及探究其機(jī)制提供前期研究基礎(chǔ)。設(shè)計miR-125a-3p前體序列及其反向互補(bǔ)序列，與慢病毒骨架質(zhì)pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體進(jìn)行酶切連接，構(gòu)建過表達(dá)與抑制表達(dá)miR-125a-3p的慢病毒表達(dá)載體。利用HEK293Ta細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，測定病毒滴度后，將獲得的miR-125a-3p過表達(dá)慢病毒顆粒感染MA104細(xì)胞和灌胃感染乳鼠，檢測miR-125a-3p的表達(dá)。同時對乳鼠進(jìn)行輪狀病毒攻毒試驗(yàn)，觀察腹瀉情況。研究成功構(gòu)建了過表達(dá)及抑制miR-125a-3p表達(dá)的慢病毒載體,獲得高效的過表達(dá)及抑制miR-125a-3p的慢病毒顆粒，成功感染MA104細(xì)胞，以及在乳鼠小腸組織有表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p過表達(dá)慢病毒感染乳鼠后對輪狀病毒引起的腹瀉有明顯的抑制作用。

miR-125a-3p；慢病毒；過表達(dá)載體；抑制表達(dá)載體；乳鼠

MicroRNA(miRNAs)是一類長度約為22個堿基的非編碼小RNA，它們通過抑制翻譯和導(dǎo)致mRNA降解兩種方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控真核生物三分之一以上基因的表達(dá)，參與了細(xì)胞的分化發(fā)育、增殖、凋亡和代謝等幾乎所有生物過程[1-2]。目前有眾多的研究表明，miRNA在個體發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤等多種生命過程中均具有重要的功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，宿主miRNA的表達(dá)模式可能通過病毒的感染而被改變，如HCV[3-4]、HIV-1[5]、EBV[6]等。這些變化反映了宿主miRNA有可能在宿主與病毒之間的相互作用中發(fā)揮一些重要的功能[7-8]。

miR-125a家族在多種病毒感染中均有發(fā)揮功能。其中，宿主可通過提高miR-125a表達(dá)水平，從而抑制HBV的增殖[9]。近期，課題組前期研究表明[10]宿主細(xì)胞MA104中的miR-125a-3p在輪狀病毒感染后表達(dá)下調(diào)，可能與宿主與病毒間的相互作用相關(guān)。人輪狀病毒[11](Human Rotavirus，HRV)是導(dǎo)致五歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最重要病原體之一。到目前為止，對于輪狀病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用研究較少，相關(guān)機(jī)制仍然不是十分清楚。

因此，本研究旨在通過構(gòu)建過表達(dá)與抑制miR-125a-3p表達(dá)的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染 MA104 細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，為將來研究miR-125a-3p對輪狀病毒增殖中的影響打下前期研究基礎(chǔ)。同時，針對miR-125a-3p在輪狀病毒感染后表達(dá)下調(diào)這一現(xiàn)象，將miR-125a-3p過表達(dá)慢病毒感染乳鼠后，感染輪狀病毒，觀察乳鼠的腹瀉情況，從而反映過表達(dá)miR-125a-3p對輪狀病毒的感染是有一定抑制作用的。

1 材料和方法

1.1 材料

MA104細(xì)胞、HEK293Ta細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM 高糖培養(yǎng)基(CORNING)，Opti-MEM(Gibco)，胎牛血清(Biological Industries)，EndoFectin-Lenti轉(zhuǎn)染試劑(廣州復(fù)能基因有限公司)， 限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I(TaKaRa公司)，pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體(北京英茂盛業(yè)生物技術(shù)有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN)，Real-time PCR 試劑(QIAGEN)，ICR乳鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 miR-125a-3p過表達(dá)與抑制表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)小RNA深度測序結(jié)果，從miRBase數(shù)據(jù)庫查找miR-125a-3p的成熟序列，設(shè)計并合成針對恒河猴miR-125a-3p的成熟序列、反相互補(bǔ)序列以及空白對照序列(negative control NC)。

分別為miR-125a-3p(ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC)、shRNAmiR-125a-3p(GGCTCCCAAGAACCTCACCTGT)和shRNAcontrol(CATCGACTAGCCACTTAGAC)。

通過BamH I和EcoR I酶將載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro以及3種DNA oligo進(jìn)行雙酶切，T4連接酶16℃過夜連接。利用感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，涂布于含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，挑選其中的陽性單克隆菌落，經(jīng)過測序和比對分析PCR鑒定陽性的克隆。分別將鑒定正確的重組過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-miR-125a-3p，抑制表達(dá)慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-shRNAmiR-125a-3p，空白對照命名為pLV-shControl-EGFP。

1.2.2 慢病毒包裝

將生長狀態(tài)良好的HEK293Ta細(xì)胞經(jīng)消化傳至10 cm圓碟中，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，將生長液換成含10% 熱滅活FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，簡稱包裝2溶液；在轉(zhuǎn)染試劑EndoFectin-Lenti的作用下，分別將構(gòu)建好的重組慢病毒質(zhì)粒pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p、pLV-shControl-EGFP與慢病毒包裝的輔助質(zhì)粒PH1和PH2共轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。

第2天將培養(yǎng)基由包裝2溶液更換為含1%雙抗和5%熱滅活FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基稱包裝3溶液；培養(yǎng)48 h后，收集含病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)1000 r/min離心2 min去除細(xì)胞碎片，將獲得的上清分裝保存至-80℃；在細(xì)胞培養(yǎng)碟中補(bǔ)充包裝3溶液后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，與48 h病毒液相同處理，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)情況。

1.2.3 慢病毒滴度測定以及濃縮純化

采用Real-time PCR法檢測慢病毒的滴度。HEK293Ta細(xì)胞傳至24孔板中，于10倍梯度稀釋病毒液，在細(xì)胞孔中加入100 μL稀釋好的病毒液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后抽提細(xì)胞總RNA，利用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。隨后以稀釋10倍的cDNA為模板Real time PCR檢測EGFP表達(dá)情況，上游引物：5′-TGCTTCAGCCGCTACCC-3′，下游引物：5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3′。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸20 s；82℃再延伸5 s，共45個循環(huán)。溶解曲線65℃～95℃，每一步增加0.5℃，保持5 s。

采用高速離心的方法進(jìn)行慢病毒的濃縮純化。將收集的慢病毒液在4℃條件下融化后，用0.44 μm濾器過濾。濾過的病毒液利用Beckman SW41轉(zhuǎn)頭于4℃條件下，26 000 r/min超速離心120 min后保留沉淀，每40 mL病毒加400 μL PBS溶解沉淀即為濃縮的病毒，將病毒液分裝凍存于-80℃。

1.2.4 MA104細(xì)胞的感染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選

胰酶消化MA104細(xì)胞，接種于6孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 待細(xì)胞融合率達(dá)40%～50%時, 更換成含5 μg/mL ploybrene的MEM培養(yǎng)基，用重組過表達(dá)慢病毒和抑制表達(dá)慢病毒上清液和空白對照病毒上清液分別感染MA104細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜; 將培養(yǎng)液更換為含 5% FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野，來觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。根據(jù)嘌呤霉素對MA104細(xì)胞最小致死濃度實(shí)驗(yàn), 加入最適濃度為8 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，將形成miR-125a-3p過表達(dá)和抑制表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-125a-3p在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MA104中的表達(dá)

將篩選到的miR-125a-3p過表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA。經(jīng)純度和濃度測定后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。再以稀釋10倍的cDNA為模板,對miR-125a-3p和U6進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。每個樣品設(shè)置2個復(fù)孔, 以U6作為內(nèi)參, 重復(fù)3次, 計算Ct平均值, 采用相對定量法進(jìn)行定量分析。

1.2.6 慢病毒感染動物實(shí)驗(yàn)

濃縮純化后病毒滴度約為2 × 108TU/mL，對5 d齡的ICR乳鼠進(jìn)行慢病毒灌胃(150 μL/只)，分成3組進(jìn)行感染：實(shí)驗(yàn)組分別是濃縮的pLV-miR-125a-3p慢病毒液，對照組灌同等體積的PBS溶液，空白組不予任何干預(yù)。灌胃72 h后取小腸進(jìn)行冷凍切片，在熒光顯微鏡下觀察小腸組織中慢病毒的綠色熒光。然后分別對試驗(yàn)組和對照組乳鼠進(jìn)行輪狀病毒灌胃攻毒試驗(yàn)，輪狀病毒滴度為107PFU，每只灌胃200 μL，觀察并記錄乳鼠的腹瀉情況。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)與抑制表達(dá)miR-125a-3p慢病毒載體的構(gòu)建

以pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p、pLV-shControl-EGFP以及空慢病毒載體為模板進(jìn)行PCR，并經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小(圖1)。

2.2 過表達(dá)與抑制表達(dá)miR-125a-3p慢病毒載體的鑒定

將篩選出來的陽性克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，后進(jìn)行測序分析，并與miR-125a-3p的成熟序列以及反相互補(bǔ)序列進(jìn)行比對，未出現(xiàn)突變或缺失等異常，可見完全相匹配(圖2)。測序結(jié)果也證明了miR-125a-3p過表達(dá)與抑制表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖 1 構(gòu)建相關(guān)載體PCR鑒定結(jié)果

1、2、3為以重組慢病毒載體為模版(1：pLV-miR-125a-3p，2:pLV-shRNAmiR-125a-3p，3: pLV-shControl-EGFP)；4為以慢病毒空載體為模版；M為DL500 DNA Marker

圖 2 shRNA序列測定結(jié)果

2.3 過表達(dá)與抑制表達(dá)miR-125a-3p重組慢病毒的包裝及滴度測定

重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察，pLV-miR-125a-3p組和pLV-shRNAmiR-125a-3p組的HEK293Ta細(xì)胞均可觀察到綠色熒光的表達(dá)(圖3)，表明重組慢病毒質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入HEK293Ta細(xì)胞中。將包裝后收獲的病毒進(jìn)行滴度測定。結(jié)果顯示，pLV-miR-125a-3p滴度為2×106TU/mL，pLVshRNAmiR-125a-3p滴度為3×106TU/mL，pLV-shControl-EGFP滴度為2× 106TU/mL(表1)。

表 1 實(shí)時定量PCR檢測慢病毒滴度

2.4 篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-125a-3p的MA104細(xì)胞系

重組慢病毒感染MA104細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡觀察，pLV-miR-125a-3p組、pLV-shRNAmiR-125a-3p組及pLV-shControl-EGFP組，MA104細(xì)胞均可見綠色熒光表達(dá)(圖4)，且隨時間的延長熒光數(shù)增多，未被慢病毒感染的細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白，表明成功包裝出具有感染活性的慢病毒粒。

A、B為pLV-miR-125a-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(A：明視野，B：暗視野)；C、D為pLV-shRNAmiR-125a-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(C：明視野，D：暗視野)；E、F為pLV-shControl-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(E：明視野；F：暗視野)本研究選取嘌呤霉素濃度為8 μg/mL作為篩選濃度,于細(xì)胞加入病毒液共培養(yǎng)后48 h，將培養(yǎng)基更換為含嘌呤霉素為8 μg/mL的5% FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。加入篩選培養(yǎng)基4 d后，待細(xì)胞基本不再死亡，對細(xì)胞進(jìn)行傳代，同時使用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基加壓篩選。因此認(rèn)為，在本研究中,病毒轉(zhuǎn)染和篩選效率均>80%。

圖4 熒光顯微鏡觀察包裝后的重組慢病毒顆粒感染MA104細(xì)胞后的表達(dá)情況

A、B為pLV-miR-125a-3p慢病毒感染MA104細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(A：暗視野，B：明視野)；C、D為pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒感染MA104細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(C：暗視野，D：明視野)

2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達(dá)量

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖5)，與空白對照組相比, pLV-miR-125a-3p的MA104細(xì)胞系中miR-125a-3p的表達(dá)水平上調(diào)70倍左右，表達(dá)量顯著增加。pLV-shRNAmiR-125a-3p的MA104細(xì)胞系中miR-125a-3p的表達(dá)水平下調(diào)了10倍左右，表達(dá)量明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 miRNA-125-3p過表達(dá)(A)和抑制表達(dá)(B)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)miRNA-125-3p的表達(dá)水平

2.6 慢病毒感染動物實(shí)驗(yàn)

灌胃72 h后，在乳鼠小腸組織中可見綠色熒光的表達(dá)(圖6)，說明包裝pLV-miR-125a-3p慢病毒可以正常感染乳鼠。確定慢病毒感染成功后，分別對實(shí)驗(yàn)組，對照組以及空白組乳鼠感染輪狀病毒，觀察乳鼠腹瀉情況。發(fā)現(xiàn)感染pLV-miR-125a-3p慢病毒的小鼠腹瀉情況有明顯的降低(圖7)。

圖6 熒光顯微鏡觀察乳鼠小腸組織切片結(jié)果

A為感染pLV-miR-125a-3p慢病毒乳鼠小腸切片；B為PBS對照組乳鼠小腸切片

3 討論

研究microRNA在生物學(xué)過程中的調(diào)控機(jī)制，通常需要通過在細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)其表達(dá)水平，來檢測相應(yīng)基因的mRNA或蛋白表達(dá)變化，從而觀察miRNA對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。目前常用上調(diào)和下調(diào)microRNAs的方法主要有電穿孔法、陽離子聚合物法、慢病毒介導(dǎo)法等。其中，慢病毒介導(dǎo)法優(yōu)點(diǎn)在于能夠感染細(xì)胞范圍廣、可將外源基因整合到宿主染色體，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)，因此被作為研究基因功能及基因下調(diào)的有效工具[12-14]。MA104細(xì)胞屬于比較難轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞，通過慢病毒介導(dǎo)的傳遞方法，可以將其攜帶的過表達(dá)和抑制miR-125a-3p的shRNA序列整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨著宿主細(xì)胞的增殖不斷擴(kuò)增，使外源基因在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定持久的表達(dá)，篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株[15]。

圖7 觀察感染輪狀病毒后乳鼠的腹瀉情況

A為PBS組感染輪狀病毒乳鼠腹瀉情況；B為感染pLV-miR-125a-3p慢病毒后感染輪狀病毒乳鼠腹瀉情況

本實(shí)驗(yàn)首先成功構(gòu)建 pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒載體，并且利用 HEK293Ta 細(xì)胞包裝產(chǎn)生具有一定感染活性的慢病毒顆粒。通過熒光顯微鏡來觀察EGF綠色熒光蛋白表達(dá)情況來確定慢病毒的感染情況并大致判斷感染效率，并且通過抗生素嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MA104細(xì)胞系。RT-qPCR的結(jié)果顯示，與對照組相比pLV-miR-125a-3p的miR-125a-3p的mRNA水平明顯上調(diào)，pLV-shRNAmiR-125a-3p與對照組相比，miR-125a-3p的mRNA水平明顯下調(diào)。

本研究中成功完成了pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒載體的包裝和滴度測定以及純化濃縮。同時，本試驗(yàn)進(jìn)一步探索研究了miR-125a-3p與輪狀病毒感染情況，預(yù)先對乳鼠感染攜帶過表達(dá)miR-125a-3p慢病毒pLV-miR-125a-3p后，再感染輪狀病毒，觀察乳鼠的腹瀉情況。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染pLV-miR-125a-3p慢病毒的乳鼠再感染輪狀病毒后，腹瀉情況明顯減輕。由此我們推測miR-125a-3p可能對于輪狀病毒的復(fù)制有一定的抑制作用。但是，由于靶基因調(diào)控的不確定性，一個靶基因可能受到多個miRNA的調(diào)控, 而miRNA也可能調(diào)節(jié)下游多個靶基因，要明確miR-125a-3p對輪狀病毒增殖過程中具體機(jī)制及靶向信號通路還需要進(jìn)一步深入研究。

[1]BARTEL D P. MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

[2]YANG J S, PHILLIPS M D, BETEL D, et al. Widespread regulatory activity of vertebrate microRNA species[J]. RNA, 2011, 17(2):312-326.

[3]JOPLING C L, YI M, LANCASTER A M, et al. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA[J]. Science, 2005, 309(5740):1577-1581.

[4]MURAKAMI Y, ALY H H, TAJIMA A, et al. Regulation of the hepatitis C virus genome replication by miR-199a[J]. J Hepatol, 2009, 50(3):453-460.

[5]TRIBOULET R, MARI B, LIN Y L, et al. Suppression of microRNA-silencing pathway by HIV-1 during virus replication [J]. Science, 2007, 315(5818):1579-1582.

[6]PFEFFER S, ZAVOLAN M, GRSSER F A，et al. Identification of virus-encoded microRNAs[J]. Science, 2004, 304(5671):734-736.

[7]GOTTWEIN E, CULLEN B R. Viral and cellular microRNAs as determinants of viral pathogenesis and immunity[J]. Cell Host Microbe, 2008, 3(6):375-387.

[8]POWDRILL M H, DESROCHERS G F, SINGARAVELU R，et al. The role of microRNAs in metabolic interactions between viruses and their hosts[J]. Curr Opin Virol, 2016, 19:71-76.

[9]Potenza N, PAPA U, MOSCA N, et al. Human microRNA hsa-miR-125a-5p interferes with expression of hepatitis B virus surface antigen[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(12):5157-5163.

[10]ZHOU Y, WU J, GENG P, et al. MicroRNA profile analysis of host cells before and after wild human rotavirus infection[J]. J Med Virol, 2016, 88(9):1497-1510.

[11]TATE J E, BURTON A H, BOSCHI-PINTO C, et al. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes:a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Infect Dis, 2012, 12(2):136-141.

[12]BAYIN N S, MODREK A S, DIETRICH A, et al. Selective lentiviral gene delivery to CD133-expressing human glioblastoma stem cells[J]. PLoS One, 2014, 9(12):e116114.

[13]HUTSON T H, FOSTER E, MOON L D, et al. Lentiviral vector-mediated RNA silencing in the central nervous system[J]. Hum Gene Ther Methods, 2014, 25(1):14-32.

[14]CHEN F L, LIN P F, LI X, et al. Construction and expression of lentiviral vectors encoding recombinant mouse CREBZF in NIH 3T3 cells[J]. Plasmid, 2014, 76:24-31.

[15]NALDINI L, BL?MER U, GALLAY P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science, 1996, 272(5259):263-267.

Construction,identification and function of recombinant lentivirus vector for rhesus miR-125a-3p

LIU Ya-lin, ZHOU Yan, GENG Pan-pan, XIE Yu-ping, QIAO Hong-tu, SUN Mao-sheng, LI Hong-jun

(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Disease, Kunming 650118， China)

To construct miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus shRNA vectors for studying its effect to diarrhea of miR-125a-3p in mice,which laid a foundation of study miR-125a-3p to provide preliminary preparation for the impact of rotavirus proliferation process and to explore the molecular mechanism, the miR-125a-3p precursor sequence and miR-125a-3p reverse complement sequence were designed, and pLVshRNA-EGFP(2A)Puro vector was used to construct recombination lentivirus plasmid. The recombinant plasmid can generate the miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus vectors. Packaged lentivirus particle contained miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus by HEK293Ta. Virus titer was detected after infection of HEK293Ta. Finally we evaluated miR-125a-3p expression after that the virus infected MA104 cell and injected mice, and diarrhea of mice that was infected by rotavirus.It is successfully to construct the miRNA-125-3p overexpression and suppression lentivirus vectors. The recombinant virus successfully infected MA104 cells and mice small intestine. miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus vector were constructed successfully，which provide a stable cell transfection vector for further study of the impact and mechanism of miR-125a-3p to rotavirus and its host.We also found that the miR-125a-3p overexpression lentivirus vector can inhibitor the diarrhea,which was infected by rotavirus.

miR-125a-3p； lentivirus vector； overexpression vector； suppression vector; suckling mice

2016-09-29；

2016-10-26

十二五重大新藥創(chuàng)制(2014ZX09102041004)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2016-I2M)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目(2016FB034)；云南省科技計劃項(xiàng)目 (2014BC008)

劉雅琳，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail： 104421990@qq.com

李鴻鈞，研究員，從事病毒疫苗研發(fā)、病毒與宿主相互關(guān)系及分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail: lihj6912@163.com

Q78

A

2095-1736(2017)03-0001-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.001