裴 薇， 梁 易， 范 靜， 安紅強， 王萬軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

鐵皮石斛多聚泛素基因Polyubiquitin1(DoUb1)的克隆及表達分析

裴 薇， 梁 易， 范 靜， 安紅強， 王萬軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

采用RACE (rapid amplification of cDNA ends) 技術(shù)獲得鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)Polyubiquitin1 (DoUb1) ，該基因全長1985 bp，開放閱讀框為1371 bp，編碼457個氨基酸殘基的親水性蛋白，分子質(zhì)量為51 179.7 ku，理論等電點pI為7.76；亞細胞定位分析表明該基因產(chǎn)物主要在細胞質(zhì)或線粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用。DoUb1與水稻、玉米及谷子等單子葉植物的多聚泛素基因親緣關(guān)系較近。實時熒光定量PCR (RT-qPCR)分析結(jié)果顯示，DoUb1在鐵皮石斛幼苗根和葉中表達量較高，莖中表達量較低；在干旱脅迫和溫度脅迫過程中的表達量都低于正常狀況，在干旱脅迫的早期，表達量降低，6 h時達到最低，之后隨脅迫時間的延長而緩慢升高；在溫度脅迫情況下，DoUb1具有與干旱脅迫相近的響應(yīng)特性，但低溫脅迫相比高溫脅迫下，DoUb1表達量更低，表明該基因?qū)Φ蜏孛{迫更敏感，結(jié)果為后期研究鐵皮石斛生長發(fā)育提供一定基礎(chǔ)。

RACE；鐵皮石斛；Polyubiquitin；RT-qPCR

細胞內(nèi)永不停歇地進行著蛋白質(zhì)的合成、更新與降解，蛋白質(zhì)的選擇性降解在這一過程中起著非常重要的作用。泛素(Ubiquitin)是這一過程中的一個重要成員。泛素是Goldstein首次于1975年從小牛胰臟中分離得到一個含76個氨基酸殘基的小肽，后來人們又發(fā)現(xiàn)該小肽廣泛存在于所有真核細胞中，并因而得名[1]。泛素基因家族可分為UbEP(UbiquitinExtensionProtein)和Polyubiquitin兩類。UbEP是只編碼1個泛素單位的泛素蛋白基因，而Polyubiquitin為多聚泛素蛋白基因，其編碼產(chǎn)物為多個串聯(lián)的泛素單位頭尾相連形成[2]。UbEP編碼的泛素單體通常作為分子伴侶參與核糖體的裝配過程，多聚泛素基因表達產(chǎn)物主要參與泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome system, UPS)中的蛋白質(zhì)水解[3]。

在高等真核生物中，Polyubiquitin基因的表達相當復(fù)雜，在不同的細胞生長、發(fā)育時期和脅迫條件下，Polyubiquitin基因表達情況不同[4]。研究發(fā)現(xiàn)高等植物在應(yīng)對高溫、嚴寒和干旱等外界非生物脅迫或生物脅迫下均會產(chǎn)生各種脅迫應(yīng)答蛋白，而這些蛋白會隨著逆境的解除而被陸續(xù)降解[5]。泛素基因在逆境條件下表達會增加，異常蛋白降解速率加快，這種結(jié)果間接說明泛素系統(tǒng)在生物逆境適應(yīng)中的作用[6]。

當細胞所處的環(huán)境溫度突然升高時，會產(chǎn)生熱激蛋白和大量的變性蛋白，當細胞所處的環(huán)境溫度突然降低，或在干旱條件下，也會產(chǎn)生一些錯誤折疊的蛋白，細胞首先會將變性蛋白或錯誤折疊蛋白作為靶蛋白進行泛素化標記，然后轉(zhuǎn)運至蛋白酶體，并降解成短肽[7]。如果泛素鏈形成或者修飾過程中有任何的失調(diào)，均會導(dǎo)致生物體內(nèi)環(huán)境的紊亂，從而產(chǎn)生嚴重病害[8]。

鐵皮石斛是一種傳統(tǒng)的中國藥用植物，具有觀賞價值和廣泛的藥用價值[9]。本文結(jié)合PCR技術(shù)獲得了鐵皮石斛多聚泛素基因DoUb1并利用RT-qPCR技術(shù)，分析在溫度脅迫、干旱脅迫條件下對鐵皮石斛DoUb1基因表達的影響，為分析脅迫對鐵皮石斛發(fā)育影響的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛成熟種子接種于1/2MS培養(yǎng)基、25℃培養(yǎng)室進行培養(yǎng)獲得試管苗，選取具4片完全伸展葉片的試管植株備用。對備用植株分別進行35℃高溫和5℃低溫以及50% PEG模擬干旱兩種類型脅迫處理，處理時間均為1～48 h。

1.2 鐵皮石斛總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成

使用Plant RNA Kit 試劑盒(Omega) 分別對備用植株的根、莖、葉組織以及脅迫處理和未脅迫處理的整苗植株提取總RNA。選擇D260 nm/D280 nm為1.8～2.0、凝膠電泳檢測結(jié)果清晰的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按cDNA合成試劑盒(TAKARA)說明書進行。

1.3 鐵皮石斛DoUb1 cDNA的獲取

根據(jù)鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的多聚泛素基因序列，利用Primer Primer 5.0設(shè)計其3′RACE的5′端巢式PCR引物(Outer Primer：5′-ATTGATTGAGAGTGTGTATGTGGTTCC-3；Inner Primer:5′-TTGAGGCTCTGTTTCCTTGTA-3′)、3′端巢式PCR引物(Outer Primer：RP5′-GTCAACGATACGCTACCTAACG-3′，Inner Primer：RNP5′-TACGTACGGCATGACAGTG-3′)，5′RACE的5′端巢式PCR引物(Outer Primer：Oligo(T)11AP5′-AGGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTVN-3′，Inner Primer：T7 promoter 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)，3′端巢式PCR引物(Outer Primer：5′-AGAACGACCTAAAGCGGG-3′；Inner Primer：5′-CAAGGAAACAGAGCCTCAACA-3′)。以cDNA為模板，使用EasyTaqDNA Polymerase (TRANSGEN BIOTECH)分別進行PCR擴增，擴增體系為25 μL (EasyTaqDNA Polymerase 0.15 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 19.35 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL)，擴增條件(退火溫度以51℃～62℃梯度考察)為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR結(jié)果進行凝膠電泳檢測，再經(jīng)過膠回收、T載體連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、藍白斑篩選并經(jīng)菌液PCR檢測無誤后，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證一致后，將測序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進行拼接得到具全長CDS的 cDNA序列。

1.4DoUb1的生物信息學(xué)分析

利用bioXM的ORF功能預(yù)測開放閱讀框[10]；利用NCBI(http：//www.ncbi.nim.nih.gov/)的BLAST在線分析工具選出與基因序列相近的其他物種序列，利用DNAMAN(LynnonBiosoft)對其進行比對分析[11]；利用Protparam軟件對DoUb1氨基酸序列進行理化性質(zhì)的分析；利用Bibsonomy軟件對多聚泛素進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[12]；使用在線工具Psort：http://psort.hgc.jp/對多聚泛素進行亞細胞定位[13]。將DoUb1進行Blastn比對，選取與其一致性在82%以上，不同植物的18條多聚泛素基因，使用MEGA6的鄰近法(NJ)構(gòu)建進化樹[14]。

圖1 DoUb1 cDNA擴增結(jié)果

A：3′RACE產(chǎn)物；B：5′RACE產(chǎn)物。M：Marker

1.5DoUb1在不同組織以及脅迫條件下的基因表達分析

通過Primer Primer5.0對已得到的克隆序列設(shè)計的定量引物為：上游引物F：5′-TCCATCTTGTTCTCCGCC9-3′，下游引物R：5′-TCCTTGTCCTGTATCTTAGCCT-3′。將提取的各類cDNA按10 μL反應(yīng)體系進行擴增(SYBR green 5 μL、cDNA 0.5 μL、MilliQ ddH2O 2.9 μL、引物各0.8 μL)，反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸25 s，45個循環(huán)；72℃延伸30 s。得出基因的相對表達量并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1DoUb1 cDNA序列的獲得以及序列分析

RACE測序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)拼接后得到1985 bp cDNA序列。圖1為3′RACE和5′RACE的PCR電泳圖，3′RACE測序得到1608 bp長度的序列，5′RACE測序得到396 bp長度的序列。拼接后的序列其5′端和3′端各有一段非編碼區(qū)，分別由402個和212個核苷酸組成，3′末端具有一個含18個A的poly(A)尾。利用BioXM軟件對其進行序列分析，開放閱讀框長度為1371 bp，位于403～1774 bp，編碼457個氨基酸蛋白殘基。經(jīng)NCBI Blastn比對，該基因與其他植物多聚泛素基因核苷酸序列相似性均在81%以上，故命名為DoPolyubiquitin1 (DoUb1)。將其編碼產(chǎn)物序列通過NCBI在線比對工具Blastp分析，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示該產(chǎn)物是由6個泛素單位所組成，每個泛素單位由76個氨基酸殘基構(gòu)成，都含有保守的Ubq-E2、Ubq-UCH、Ubq-CUE作用位點(圖2)；序列比對結(jié)果顯示，該產(chǎn)物序列與其他物種的多聚泛素蛋白的“query cover”均在99%以上、“identical”在97%以上；選擇與DoUb1編碼產(chǎn)物比對結(jié)果中“Max. score”最高的5個物種的多聚泛素蛋白序列進行同源分析，結(jié)果如圖3所示，此基因的結(jié)構(gòu)域非常保守，藍色部分表示比對結(jié)果完全相同，粉紅色部分和綠色部分表示比對結(jié)果部分同源，同源性極高，進一步證明克隆得到的基因為多聚泛素基因。

圖2 DoUb1保守域預(yù)測

圖3 不同物種氨基酸序列的多重比對

圖中各條序列的accesion number為：TuUb (Triticumurartu, gi|474093556)、ZmUb (Zeamays, gi|413926513)、OsUb (Oryzasativa, gi|530684260)、PsUb (Pucciniastriiformis, gi|909605082)、NtUb (Nicotianatomentosiformis, gi|697128365)

2.2DoUb1生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用Protparam軟件對DoUb1氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明其分子質(zhì)量為51 179.7 ku，分子式為C2250H3747N637O704S6，總原子數(shù)為7344，理論等電點pI為7.76，帶負電荷的殘基數(shù)為66、正電荷殘基數(shù)為67。不穩(wěn)定系數(shù)為27.92，表明該蛋白狀態(tài)穩(wěn)定。疏水性分析結(jié)果表明，其疏水性最大值為1.133，親水峰最大值為-1.956，表明整個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出親水性(圖4)。利用Bibsonomy軟件對DoUb1進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(alpha helix)占43.54%，延伸鏈(extended strand)占15.97%，無規(guī)則卷曲(random coil)占40.48%。由此表明，α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分(圖5)。

圖4 DoUb1蛋白質(zhì)的疏水性分析

藍色：α螺旋；紅色：延伸鏈；紫色：無規(guī)則卷曲

使用在線工具Psort (http://psort.hgc.jp/)對DoUb1進行亞細胞定位分析。結(jié)果顯示，其主要定位于細胞質(zhì)以及線粒體基質(zhì)，概率分別0.45和0.36，說明該基因產(chǎn)物主要在細胞質(zhì)或線粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用，可能主要參與高等植物細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)運輸?shù)取?/p>

圖6 不同物種多聚泛素基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖中各條序列的基因號所對應(yīng)的物種名稱為：gi|955717825(Setariaitalica)；gi|6013288(Oryzasativa)、gi|747099717(Sesamumindicum)、gi|1027097414(Prunusmume)、gi|702352129(Eucalyptusgrandis)、gi|670407636(Zeamays)、gi|743832386(Elaeisguineensis)、gi|971573297(Solanumtuberosum)、gi|734988342(Prunuspersica)、gi|694426526(Pyrus)、gi|802559699(Jatrophacurcas)、gi|1026010145(Capsicumannuum)、gi|657959169(Malus)、gi|697170903(Nicotiana)、gi|1021567367(Arachisipaensis)、gi|985444137(Citrussinensis)、gi|33323473(Musaacuminate)、gi|823131848(Gossypiumraimondii)

利用MEGA6構(gòu)建鐵皮石斛DoUb1與其他物種多聚泛素基因的進化樹，結(jié)果如圖6所示。其中Ⅰ類為單子葉植物，Ⅱ類為雙子葉植物。DoUb1與水稻、玉米及谷子的多聚泛素基因聚為一簇，并與另2個植物多聚泛素基因(芭蕉、油棕)相鄰，而這6個物種都為單子葉植物；薔薇科雙子葉植物海棠、梨、桃和梅花的多聚泛素基因聚為一支；自花授粉雙子葉植物芝麻、煙草、辣椒和馬鈴薯的多聚泛素基因聚為一支。進化樹分析結(jié)果與植物分類學(xué)特征具有較高的一致性。

2.3DoUb1在不同組織以及脅迫條件下的基因表達分析

以鐵皮石斛Actin作為內(nèi)參基因，進行熒光定量PCR的分析，結(jié)果如圖7所示。DoUb1在鐵皮石斛幼苗根和葉中表達量較高，而在莖中的表達量較少，約為根中表達量的一半(圖7-A)。干旱初期基因表達量下降，到脅迫處理6 h，表達量降到最低，然后緩慢回升，表達量升高，說明泛素基因與鐵皮石斛抗逆過程有關(guān)。由此可以推測，當細胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時，產(chǎn)生錯誤折疊的蛋白質(zhì)，泛素可活化并標記它們以供降解(圖7-B)。高溫脅迫使得鐵皮石斛泛素基因表達量逐漸降低，6 h表達量約為正常表達量的20%，達到最低值，而后又逐漸升高；而在低溫脅迫下，DoUb1在脅迫初期表達量急劇下降，脅迫1 h時約為正常表達量的4%，在6 h和48 h有一個表達量的升高，但低溫脅迫相比高溫脅迫，DoUb1表達量更低。由此說明泛素基因在低溫脅迫下的響應(yīng)更為敏感(圖7-C)。

圖7 DoUb1在不同組織以及脅迫下的表達分析

A：不同組織DoUb1的表達水平；B：干旱脅迫下DoUb1的表達水平；C：溫度脅迫下DoUb1的表達水平

3 討論

植物在自然環(huán)境中通常會遭遇多種逆境脅迫的侵襲，即綜合逆境脅迫[15]。植物對于綜合脅迫的響應(yīng)不僅僅是對各種逆境反應(yīng)的簡單加和，還有某些特殊機制[16]。在植物生長過程中，溫度脅迫和干旱脅迫是一種比較普遍的逆境，而且會對植物造成比較大的傷害[17]。泛素可以提高植物對脅迫抗性的作用[18]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在細胞內(nèi)會參與眾多的調(diào)節(jié)過程，不僅在植物的正常生長發(fā)育過程中起作用，而且在溫度、干旱以及疾病等生物和非生物脅迫中也發(fā)揮了重要作用[19]。在鐵皮石斛中，通過對DoUb1的表達進行分析，不同的脅迫條件下，泛素所對應(yīng)的機制不同，其表達量也有所變化。Ubiquitin能夠共價結(jié)合到底物蛋白上，對底物蛋白進行翻譯后的修飾[20]。通常情況下，逆境脅迫下生物細胞內(nèi)無功能蛋白質(zhì)或錯誤蛋白質(zhì)的積累增多，而及時清除這些無功能或錯誤蛋白質(zhì)成為生物適應(yīng)逆境的重要方式[21]。在鐵皮石斛中，泛素基因的表達與植物抗逆性有關(guān)，在干旱以及溫度脅迫下，表達都會發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的變化。泛素蛋白酶體系統(tǒng)，不僅是植物中蛋白高效專一降解最精致的調(diào)控機制之一，也是整個真核生物蛋白高效專一降解最重要的調(diào)控機制之一[22]。

非生物脅迫下，首先在泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme E1)的催化作用下獲得活性，再經(jīng)過酶以及一系列中間底物的催化過程，將其連接到靶蛋白上，最終完成錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解過程[23]。許多刺激和細胞內(nèi)上游信號事件可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化，泛素化在生物體內(nèi)復(fù)雜得多，主要是泛素與其他蛋白質(zhì)相互作用有較大的表面積，泛素能形成不同鏈的事實進一步增大了其復(fù)雜性[24]。DoUb1為6個泛素分子形成的多聚泛素，其空間構(gòu)象與單泛素分子明顯不同，造成了其與底物蛋白分子不同的結(jié)合方式。泛素為難于標記的靶點提供了一個切入點[25]。

多聚泛素基因能在分生組織、微管組織和衰老組織中被熱激和創(chuàng)傷等誘導(dǎo)脅迫下表達，其表達產(chǎn)物主要參與泛素蛋白酶體途徑中的蛋白質(zhì)水解過程[26]。脅迫條件下，多聚泛素被激活以提供自由泛素，并且細胞優(yōu)先降解蛋白質(zhì)[27]。DoUb1在非生物脅迫下，表達量降低，可能是脅迫條件下對泛素基因的表達水平產(chǎn)生了一定影響，脅迫后期表達量慢慢回升，說明其對脅迫反應(yīng)的調(diào)整性及適應(yīng)性，在蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮積極作用。

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Cloning and expression analysis of aPolyubiquitingene (DoUb1) in theDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

PEI Wei， LIANG Yi， FAN Jing， AN Hong-qiang， WANG Wan-jun

(College of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

Polyubiquitin1 (DoUb1) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo was achieved by RACE (rapid amplification of cDNA ends).DoUb1 contained 1985 bp nucleotides with a putative open reading frame encoding 457 amino acid residues. The predicted molecular weight and theoretical isoelectric point of pI were 51 179.7 ku and 7.76 respectively. Subcellular localization analysis showed that gene product played a major role in the cytoplasm or the mitochondrial matrix. Phylogenetic analysis showed that theDoUb1 has the closest relativon with monocotyledonous plants such asZeamays,SetariaitalicaandOryzasativa. Results of real-time quantitative PCR (RT-qPCR) showed that the expression ofDoUb1 was higher in roots and leaves than in stems;DoUb1 was down-regulated during drought stress and temperature stress, the expression level was reduced in the early stage of stresses and then slowly increased. For drought stress, and the expression level was at the lowest after PEG treatment for 6 h; for temperature stress, it had similar responsive characteristics to drought stress, but in the low temperature stress, the expression ofDoUb1 was lower than in high temperature stress. These results showed that the gene was more sensitive to low temperature stress.

RACE；DendrobiumofficinaleKimuraetMigo；Polyubiquitin； RT-qPCR

2016-06-15；

2016-07-13

國家自然科學(xué)基金項目(31371232)

裴 薇，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: 1141217319@qq.com

王萬軍，教授，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: wanjunwang@home.swjtu.edu.cn

Q785;Q786

A

2095-1736(2017)03-0006-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.006