袁翊朦， 李康秀， 王春琳， 母昌考， 李榮華， 宋微微

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠體內(nèi)重金屬的脫除作用

袁翊朦， 李康秀， 王春琳， 母昌考， 李榮華， 宋微微

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

研究了烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠體內(nèi)重金屬的脫除作用。將小鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、黑色素組、重金屬組、重金屬和黑色素組，分別灌胃生理鹽水、黑色素懸濁液、重金屬溶液、重金屬和黑色素混合液。連續(xù)灌胃7 d后，計(jì)算脾臟指數(shù)，測(cè)定小鼠血液、股骨和糞便中重金屬鉛(Pb)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、鋇(Ba)含量，以及肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果顯示，灌胃重金屬和黑色素后，與重金屬組相比，Pb、Cr、Ba在血液、股骨中含量顯著下降，在糞便中含量顯著上升；Cd在血液、股骨中含量也降低，在糞便中含量顯著上升。灌胃黑色素后，與正常組相比，脾臟指數(shù)變化不顯著；SOD、GSH-Px活力下降，MDA含量上升。提示烏賊墨汁黑色素對(duì)Pb、Cd、Cr、Ba有減少吸收，促進(jìn)排出的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

烏賊墨汁黑色素；脫除；重金屬

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬資源得到大力開發(fā)，它們可經(jīng)多種途徑進(jìn)入人體，對(duì)健康構(gòu)成威脅。Pb、Cd、Cr和Ba是常見的有毒重金屬。Pb可經(jīng)消化道、呼吸道進(jìn)入人體，烷基鉛可經(jīng)皮膚吸收，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、肝臟、腎臟等造成損害[1]。兒童血鉛事件的發(fā)生，使Pb污染備受關(guān)注。Cd為已知最易在體內(nèi)蓄積的毒物。研究證明，無論從毒性還是蓄積作用看，Cd已成為繼Hg、Pb之后威脅人類健康的第3位金屬元素[2]，在水稻、貝類中時(shí)有超標(biāo)。Cr中毒大都由Cr(VI)引起，它可影響機(jī)體氧化、還原和水解過程，刺激皮膚黏膜，有致癌作用[3]。溶解度較大的鋇鹽，毒性較大，過量攝入可引起急、慢性Ba中毒, 有肌肉毒性、免疫毒性、生殖毒性，會(huì)導(dǎo)致遺傳毒理上的三致效應(yīng)(致突變(mutagenesis)、致癌(carcinogenesis)和致畸(teratogenesis)效應(yīng))[4]。

烏賊墨是烏賊遇到天敵時(shí)噴出的黑色物質(zhì)，化學(xué)成分主要為黑色素和蛋白多糖復(fù)合體[5]，具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抗菌[8-9]、抗輻射[10-11]等生物活性。烏賊墨黑色素由黑色素單體(包括5, 6-二羥基吲哚和 5, 6-二羥基吲哚-2-羧酸)堆積而成，它存在不同的基團(tuán)，如-COOH、-NH2、-OH等，具有結(jié)合潛在毒性陽(yáng)離子(如一些過渡金屬)的特性。Lian等[12]利用紅外吸收光譜法檢測(cè)了烏賊墨黑色素顆粒與二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)金屬離子和黑色素的-COOH、-NH2和-OH等官能團(tuán)相互作用。劉漫等[13]進(jìn)行了烏賊墨黑色素吸附溶液中Pb2+的實(shí)驗(yàn)，分別考察了初始離子濃度、溶液pH值、吸附溫度、吸附作用時(shí)間、烏賊墨黑色素添加量對(duì)吸附的影響。呂玲等[14]對(duì)24 h內(nèi)Pb中毒小鼠進(jìn)行烏賊墨黑色素灌胃治療，測(cè)定小鼠血液、肝臟以及腦組織中的Pb含量，發(fā)現(xiàn)排Pb效果顯著。呂玲等[15]進(jìn)行了不同劑量烏賊墨黑色素排Pb作用，及其對(duì)體內(nèi)Ca、Zn、Cu含量影響的研究?？梢姡w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已表明，烏賊墨黑色素對(duì)Pb有脫除作用。而烏賊墨黑色素對(duì)其他重金屬的體內(nèi)代謝作用還沒有報(bào)道。另外，已有研究表明，其他來源的黑色素可脫除生物體內(nèi)重金屬。Nogaj等[16]通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明外源添加人工合成的黑色素對(duì)Zn2+和Co2+離子的體內(nèi)分布、排出以及蓄積有顯著影響。王哲鵬等[17]發(fā)現(xiàn)烏雞黑色素在果蠅體內(nèi)具有一定排Pb解毒作用。神經(jīng)黑色素能夠與Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Co、Hg、Pb和Cd等結(jié)合[18]，其中與Fe的作用可能和帕金森病有關(guān)[19]。雷敏等[20]經(jīng)小鼠灌胃后發(fā)現(xiàn)，魷魚墨黑色素能阻礙Pb、Cd、Cr、Ba在小鼠體內(nèi)的吸收和累積，促進(jìn)排出體外。

基于重金屬污染的嚴(yán)重性和烏賊墨汁黑色素脫除體內(nèi)重金屬的潛能，本研究以小鼠為研究對(duì)象，灌胃重金屬溶液和烏賊墨汁黑色素溶液，計(jì)算臟器指數(shù)，測(cè)定血液、股骨、糞便中的重金屬含量及酶活，以分析烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠體內(nèi)重金屬的脫除作用，為黑色素脫除生物體內(nèi)重金屬和烏賊資源的充分利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

曼氏無針烏賊購(gòu)自福建東海區(qū)漁民，收集墨囊重量為：(3.0±0.5)g。ICR種類健康小鼠40只，(36.0±4.3)g，雌雄不限，隨機(jī)挑選，由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器

Ba(OH)2·6H2O、CrCl2、PbAc2、CdCl2·2.5H2O、生理鹽水(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蛋白定量檢測(cè)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SPECTRA max190酶標(biāo)儀(Molecular Devices 公司)；重金屬檢測(cè)儀(加拿大AVVOR)；FreeZone4.5 臺(tái)式冷凍干燥機(jī)(Labconco公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑色素的提取

[21]，并通過實(shí)驗(yàn)室已有優(yōu)化的方案，采用酶解法制備較高濃度的曼氏無針烏賊墨汁黑色素，主要的工藝流程如下：剖開烏賊腹部，取出墨囊，并剪開囊膜，擠出墨汁。加入蒸餾水?dāng)嚢?、洗滌，用粗濾布除去雜物后，用堿液調(diào)至pH 10.5；在攪拌下，加堿性蛋白酶水解4 h，酶解溫度為50℃，95℃加熱10 min終止反應(yīng)，8000 r/min室溫下離心收集沉淀；所得沉淀物經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌、離心，至洗滌水為中性，真空冷凍干燥。以生理鹽水配成懸濁液，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)

將40只小鼠隨機(jī)分為正常組(N)，黑色素組(M)、重金屬組(H)、重金屬和黑色素組(HM)，每組10只，分別灌胃等體積生理鹽水、黑色素懸濁液、重金屬溶液(Pb2+、Cd2+、Cr2+和Ba2+混合溶液)，重金屬和黑色素混合液。135.7 mg黑色素用100 mL生理鹽水配置。重金屬溶液配置見表1[20]，重金屬用等體積生理鹽水溶解。重金屬和黑色素混合液中，黑色素與重金屬質(zhì)量比為1∶1，用等體積生理鹽水配置。每組灌胃液體均為100 mL/kg·bw·d。每3 d稱體重，按照體重灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d。每天收集小鼠糞便。最后1次給藥灌胃后禁食不禁水12 h，稱重后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，仔細(xì)剝離脾臟、肝臟、股骨。稱量脾臟的質(zhì)量，計(jì)算脾臟/體重的比值。其余組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 重金屬溶液的配置[20](Vc調(diào)pH=4.0)

1.3.3 脾臟指數(shù)的計(jì)算

解剖時(shí)，稱量脾臟及體重，計(jì)算脾臟指數(shù)。計(jì)算公式如下：

脾臟指數(shù)=脾臟鮮重(mg)/體重(g)

1.3.4 血液、股骨和糞便中重金屬含量的測(cè)定

采用消化法處理血液樣品。吸取一定體積的血樣于250 mL消化瓶，加入濃酸混合液(濃硝酸∶高氯酸=4∶1)。將消化瓶放到可調(diào)溫電爐上，先小火均勻加熱，當(dāng)氣泡減少時(shí)，加大火力，直至瓶?jī)?nèi)溶液呈澄清的無色或淡黃色。冷卻至室溫，將消化液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，定容。

采用灰化法處理糞便和股骨樣品。干凈坩堝，經(jīng)稀鹽酸處理，在馬弗爐內(nèi)加熱至550℃～600℃，30 min后取出，于干燥器中冷卻至室溫。分別稱取糞便樣品5 g，置于已稱重的坩堝中，在電爐上燒至無煙后，再移入馬弗爐內(nèi)加熱至550℃，直至樣本呈現(xiàn)白色殘?jiān)?碳化完全)。于干燥器中冷卻至室溫后，用10%硝酸溶解，定容至25 mL。同法處理股骨樣品。

以上處理過的血液、股骨和糞便，利用重金屬檢測(cè)儀，測(cè)定樣品中的Pb、Cd、Cr和Ba含量。

1.3.5 生化指標(biāo)的測(cè)定

取小鼠部分肝臟，稱量，按重量(g)∶體積(mL)為1∶9 的比例加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)坐冰勻漿，制得10%的組織勻漿。2500 r/min離心10 min，取上清液置于-80℃冰箱備用。測(cè)定蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)法)，測(cè)定小鼠肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)含量，均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組小鼠的脾臟指數(shù)

不同處理組小鼠脾臟指數(shù)結(jié)果見表2。與正常組相比，灌胃黑色素后，脾臟指數(shù)上升8.56%；灌胃重金屬后，脾臟指數(shù)上升11.92%，均無顯著變化。與重金屬組相比，灌胃重金屬和黑色素后，脾臟指數(shù)上升19.57%，變化不顯著。

2.2 小鼠各組織中重金屬的含量

2.2.1 小鼠各組織中Pb的含量

不同處理組3種組織中Pb含量結(jié)果見表3。與正常組相比，灌胃黑色素后，血液、股骨和糞便中Pb含量分別上升2.75%、7.32%和0.54%，變化不顯著。灌胃重金屬后，與正常組相比，血液、糞便中Pb含量變化顯著(P<0.01)，分別上升112.01%和119.00%，股骨中Pb含量上升31.71%，但不顯著。與重金屬組相比，重金屬和黑色素組，血液和股骨中Pb含量均顯著下降(P<0.01)，分別為32.15%和24.07%，糞便中Pb含量顯著上升37.47%(P<0.01)。

表2 不同處理組小鼠脾臟指數(shù)

注：與正常對(duì)照組相比，“#”P<0.05；“##”P<0.01；與重金屬組相比

“*”P<0.05；“**”P<0.01。下同

表3 不同處理組小鼠各組織中Pb的含量

2.2.2 小鼠各組織中Cd的含量

不同處理組3種組織中Cd含量結(jié)果見表4。與正常組相比，灌胃黑色素后，血液、股骨中Cd含量變化不顯著，糞便中Cd含量變化顯著，上升31.38%(P<0.01)。灌胃重金屬后，與正常組相比，血液、糞便中Cd含量變化顯著，分別上升117.56%(P<0.01)、78.46%(P<0.01)；股骨上升6.25%，變化不顯著。與重金屬組相比，灌胃重金屬和黑色素后，血液、股骨中Cd含量分別下降52.98%(P<0.01)和11.76%，糞便中Cd含量上升14.40%(P<0.01)。

表4 不同處理組小鼠各組織中Cd的含量

2.2.3 小鼠各組織中Cr的含量

不同處理組3種組織中Cr含量結(jié)果見表5。與正常組相比，灌胃黑色素后，血液中Cr含量無明顯變化，股骨、糞便中也無明顯變化，分別上升4.55%和9.10%。灌胃重金屬后，與正常組相比，血液、股骨、糞便中Cr含量有顯著上升，分別變化27.50%(P<0.01)、79.55%(P<0.01)及80.88%(P<0.01)。重金屬和黑色素組，與重金屬組相比，血液、股骨中Cr含量分別降低17.60%(P<0.01)及51.90%(P<0.01)，糞便中上升57.07%(P<0.01)。

表5 不同處理組小鼠各組織中Cr的含量

2.2.4 小鼠各組織中Ba的含量

不同處理組3種組織中Ba含量結(jié)果見表6。與正常組相比，灌胃黑色素后，血液、股骨、糞便中Ba含量分別上升4.47%、8.33%和10.23%，差異不顯著。灌胃重金屬后，與正常組相比，血液、股骨、糞便中Ba含量分別上升81.64%(P<0.01)、43.56%(P<0.05)及60.45%(P<0.01)，均差異顯著。與重金屬組相比，重金屬和黑色素組中，血液、股骨中Ba含量變化顯著，分別下降41.94%(P<0.01)和42.48%(P<0.01)，糞便中Ba含量上升28.25%(P<0.01)。

表6 不同處理組小鼠各組織中Ba的含量

2.3 不同處理組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量

不同處理組小鼠肝臟酶活和MDA含量結(jié)果見表7。與正常組相比，灌胃黑色素后，肝臟中SOD、GSH-Px活力分別降低19.40%(P<0.05)和14.16%；MDA含量升高35.41%，變化不顯著。灌胃重金屬后，與正常組相比，SOD、GSH-Px活力分別降低21.91%(P<0.01)和12.14%；MDA含量升高49.65%(P<0.05)。與重金屬組相比，灌胃重金屬和黑色素后，SOD活力變化顯著(P<0.01)，GSH-Px活力和MDA含量變化不顯著，分別增加21.99%、1.79%和15.64%。

表7 不同處理組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量

3 討論

重金屬經(jīng)胃腸道攝入后，可進(jìn)入血液循環(huán)，經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化，蓄積在組織器官中，造成多種形式的損傷。而烏賊墨汁黑色素中的-COOH、-NH2、-OH等基團(tuán)，具有結(jié)合潛在毒性陽(yáng)離子的特性。另外黑色素還具有增強(qiáng)免疫功能[22]、抗氧化[7]等生物活性。本文通過灌胃小鼠觀察了烏賊墨汁黑色素對(duì)Pb、Cd、Cr和Ba的脫除作用，以及對(duì)小鼠脾臟和肝臟的影響。

研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)灌胃黑色素后，小鼠血液、股骨、糞便中Pb含量變化不顯著，說明黑色素對(duì)內(nèi)源性Pb脫除不明顯。灌胃重金屬組血液和糞便中Pb顯著上升，股骨變化不顯著；混合灌胃黑色素和重金屬組血液、股骨中Pb顯著下降，糞便中Pb顯著上升，可以看出黑色素能夠減少機(jī)體對(duì)Pb吸收和蓄積，促進(jìn)排出。呂玲等[15]發(fā)現(xiàn)高劑量、中劑量烏賊墨黑色素對(duì)血液、肝臟有一定的排Pb作用。雖然烏賊墨來源不同，但都呈現(xiàn)排Pb的效果。

灌胃黑色素對(duì)小鼠血液、股骨中Cd含量影響不明顯，糞便中Cd含量顯著上升。灌胃重金屬組血液和糞便中Cd含量顯著上升，股骨中Cd含量變化不顯著；混合灌胃黑色素和重金屬組血液中Cd含量顯著降低，糞便中顯著上升，說明黑色素對(duì)Cd也具有脫除效果。

Ba和Cr在不同處理中的含量變化趨勢(shì)一致。單獨(dú)灌胃黑色素時(shí)，血液、股骨和糞便中的Ba和Cr含量均無明顯變化，說明黑色素對(duì)內(nèi)源性Ba和Cr脫除效果不明顯。灌胃重金屬組血液、股骨和糞便中Ba和Cr含量均顯著上升；混合灌胃黑色素和重金屬組Ba和Cr在血液、股骨中顯著下降，在糞便中顯著上升，說明烏賊墨汁黑色素對(duì)Ba和Cr脫除效果明顯。

脾臟是重要的免疫器官，含大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，參與體液免疫和細(xì)胞免疫。脾臟指數(shù)，在一定程度上反映了機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，脾臟指數(shù)是幾種元素綜合作用的結(jié)果，重金屬組小鼠脾臟指數(shù)沒有顯著變化，說明短期的攻毒實(shí)驗(yàn)沒有造成內(nèi)臟的損傷。同時(shí)，在黑色素的作用下，脾臟指數(shù)變化不顯著，也說明了黑色素灌胃的安全性。

肝臟能參與機(jī)體解毒及排泄過程，是重金屬在體內(nèi)代謝最活躍的器官之一。重金屬可誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基[23]，自由基會(huì)和脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致終產(chǎn)物丙二醛(MDA)在體內(nèi)積累，造成氧化損傷。抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)，能夠及時(shí)清除自由基，保護(hù)組織細(xì)胞免受其破壞。另一方面，重金屬會(huì)與抗氧化酶相互作用而影響酶活性[24-25]。本實(shí)驗(yàn)中，灌胃黑色素后，SOD、GSH-Px活力較正常組下降，MDA含量上升。黑色素作為一種獨(dú)特的高分子聚合物，不僅能清除自由基，還具有自由基特性[26]。正常機(jī)體內(nèi)，抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，可能烏賊墨汁黑色素介導(dǎo)自由基信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，反饋調(diào)節(jié)了抗氧化酶。與重金屬組相比，灌胃重金屬和黑色素后，SOD活力顯著上升，GSH-Px活力也有所上升，說明烏賊墨汁黑色素可有效抵抗重金屬引起的氧化損傷，與已有研究中[20,27-28]黑色素通過提高SOD，GSH-Px活力，而起到抗氧化作用的結(jié)果一致。

綜上所述，烏賊墨汁黑色素對(duì)Pb、Cd、Cr和Ba有減少吸收、促進(jìn)排出的作用，對(duì)不同重金屬離子的脫除作用存在差異，一方面是4種重金屬離子在體內(nèi)的富集方式存在差異，另一方面黑色素對(duì)4種離子的作用效果也有差別。同時(shí)黑色素對(duì)小鼠脾臟無明顯損傷，還可以經(jīng)過提高抗氧化酶的活力，來抵抗重金屬引起的氧化損傷。具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討，比如烏賊墨汁黑色素在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分布情況，不同元素之間的交互作用，黑色素在促進(jìn)有毒金屬排出的同時(shí)，對(duì)必需金屬(如Ca、Zn)是否具有親和力等，以確定其安全性，為機(jī)體重金屬脫除劑的應(yīng)用提供依據(jù)。

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Removal of heavy metals in mice by melanin from sepia

YUAN Yi-meng, LI Kang-xiu, WANG Chun-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua, SONG Wei-wei

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Science of Ningbo University， Ningbo 315211, China)

In this study, we used mouse model to analyze the removal of heavy metals by melanin extracted from sepia. The mice were randomly divided into 4 groups: as the control group, melanin group, heavy metals group, heavy metals and melanin group, which were treated by gavage with saline, melanin, heavy metals, heavy metals and melanin, respectively. After a trial period of 7 days, we calculated the data of experimental animals, such as spleen index, heavy metal(Pb,Cd,Cr and Ba) contents in different organs, activities of enzymes (SOD,GSH-Px)， and the content of MDA. The results showed that Pb, Cr and Ba contents decreased significantly in blood and femur, and increased significantly in feces after heavy metals and melanin were administered compared with the heavy metals group. Besides, in contrast with heavy metals group, Cd content in of the heavy metals and melanin group dropped in blood and femur, and significantly rised in feces as well. As for melanin group, it had no significant change in spleen index by comparison with the control group. The activities of SOD, GSH-Px in melanin group were lower than the control group while the content of MDA was higher. Thus, sepia melanin appeared to help reduce Pb, Cd, Cr and Ba absorption and promote excretion.

melanin from sepia； removal； heavy metals

2016-07-04；

2016-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41206114，41176124)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ12C19002)；浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(Z3110482)；寧波市重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C11001)；寧波大學(xué)“水產(chǎn)”浙江省重中之重開放基金

袁翊朦，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物利用，E-mail:ahyfyym@yeah.net

宋微微，講師，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物利用，E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

R595.2; R285.5

A

2095-1736(2017)03-0037-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.037