盧志偉,王 磊,張利英,何進(jìn)鵬,丁 楠,任春貞,李 玲,王鳳梅,劉永琦，2

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室，3.甘肅省空間輻射生物學(xué)重點實驗室，中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

黃芪多糖對電離輻射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化潛能的影響

盧志偉1,王 磊1,張利英1,何進(jìn)鵬3,丁 楠3,任春貞1,李 玲1,王鳳梅1,劉永琦1，2

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室，3.甘肅省空間輻射生物學(xué)重點實驗室，中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

目的 研究黃芪多糖對X射線照射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化的干預(yù)作用。方法 采用CCK-8 法篩選不同濃度的黃芪多糖作用于2GyX射線輻射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞形態(tài)計數(shù)X射線對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響；甲苯胺藍(lán)染色檢測X射線對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中尼氏體的表達(dá)量；Western blot檢測神經(jīng)巢蛋白(Nestin)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)表達(dá)變化。結(jié)果 與對照組相比，X射線照射后細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.05)，與單純照射組比較，加藥照射組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖水平顯著增加(P<0.05)，其中黃芪多糖濃度為50 mg·L-1時促增殖作用最強(qiáng)，設(shè)為最佳藥物濃度；單純輻射后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯降低(P<0.05)，當(dāng)給予黃芪多糖干預(yù)后分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯上升(P<0.05)；輻射后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中尼氏體的表達(dá)量降低(P<0.05)，當(dāng)給予黃芪多糖干預(yù)后，尼氏體的表達(dá)量明顯增多；單純輻射后Nestin及NSE表達(dá)量降低(P<0.05)，而當(dāng)給予黃芪多糖干預(yù)后，Nestin和NSE表達(dá)量升高(P<0.05)。結(jié)論 黃芪多糖對電離輻射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化潛能的影響具有保護(hù)作用。

黃芪多糖；電離輻射；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)分化潛能；尼氏體；保護(hù)作用

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制及參與損傷組織的修復(fù)等能力已成為治療骨科、心血管、神經(jīng)、腫瘤、組織退化、炎癥損傷等領(lǐng)域強(qiáng)有力的工具[1-3]。在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為骨、軟骨、神經(jīng)、心肌、脂肪、內(nèi)皮等細(xì)胞。因此，目前BMSCs已廣泛地應(yīng)用于臨床作為組織損傷修復(fù)的理想種子細(xì)胞。然而，目前隨著輻射醫(yī)學(xué)在臨床診斷及臨床治療中的應(yīng)用，BMSCs 受電離輻射損傷后是否影響其分化潛能的研究較少。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)作為黃芪的主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)具有抗癌、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化、減輕化療藥物的毒副等作用[4-7]。所以本實驗主要研究輻射損傷后對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響，以及黃芪多糖對此過程的防護(hù)作用，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的正常應(yīng)用于臨床提供防護(hù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號：SKYJH-1112 )；X-ray(美國Faxitron公司，型號：Cabinet X-ray system)；infinite m200 pro 型全波長酶標(biāo)儀(瑞士 TECAN 公司)；0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司，批號：J150037)；CCK-8 試劑盒(上海東仁公司，批號：JQ702)；黃芪多糖(上海源葉生物科技有限公司，批號：ZD1219LA13)；NSE抗體(Abcam，批號：ab79757)；Nestin抗體(Proteintech，批號：66259-1-Ig)；兔抗人GAPDH多克隆抗體(abcam,批號：ab9485)；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標(biāo)記(北京中杉金橋，貨號：ZB-2301)；山羊抗小鼠IgG辣根過氧化物酶標(biāo)記(北京中杉金橋，貨號：ZB-2305)；甲苯胺藍(lán)染液(北京索來寶公司，貨號：T8240)。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) HMSC-bm(賽業(yè)生物科技有限公司，批號：7500)。細(xì)胞培養(yǎng)液為BMSCs 專用培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)，內(nèi)含440 mL成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mL成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞專用胎牛血清、5 mL青霉素鏈霉素(雙抗)和5 mL谷氨酰胺(批號：HUXMA-90011)。

黃芪多糖用BMSCs專用培養(yǎng)基溶解，濃度為1 g·L-1。細(xì)胞用60 mm培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，待細(xì)胞融合度約達(dá)到90%后，0.25%胰蛋白酶對其消化傳代，第5代細(xì)胞用于實驗。

1.3 照射條件和實驗分組 RX-650 X射線輻照裝置由中國科學(xué)院近代物理研究所提供，劑量率為0.4 Gy·min-1(100 keV，5 mA)，總劑量2 Gy，時間5 min，距輻射源高度70 cm，實驗分對照組(CTRL)，單純加藥組(APS)，單純照射組(IR)，加藥照射組(IR+APS)。

1.4 實驗方法

1.4.1 CCK-8 法檢測不同濃度的APS 對輻射細(xì)胞增殖的影響 BMSCS培養(yǎng)到90%的融合度時用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板(每孔2×103/100 μL)，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。貼壁后加入不同濃度為的APS 100 μL，對照孔和模型孔加入100 μL的BMSCs專用培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔，其余孔加入200 μL PBS。繼續(xù)培養(yǎng)3 d，照射前棄掉50 μL培養(yǎng)基，空白組用0.3 mm厚的鉛板進(jìn)行遮擋，其余孔進(jìn)行X射線2.0 Gy劑量輻照,輻射后棄掉剩余的培養(yǎng)基，加入100 μL的BMSCs專用培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1～5 d進(jìn)行CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖水平。

1.4.2 經(jīng)典的化學(xué)藥物誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化及成神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量 BMSCS細(xì)胞培養(yǎng)到90%的融合度時用胰酶消化，用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，并以1×108·L-1接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，單純加藥組和輻射加藥組加入50 mg·L-1的APS 2 mL，其余組加入等體積的BMSCs專用培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，并用2 Gy的X射線進(jìn)行輻射，輻射后棄去剩余的培養(yǎng)基，加入含1 mmol·L-1β-巰基乙醇的無血清培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，計數(shù)成神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。

1.4.3 甲苯胺藍(lán)染色觀察BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞尼氏體的表達(dá)變化 BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)到90%的融合度時用胰酶消化，用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，并以1×108·L-1接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，單純加藥組和輻射加藥組加入50 mg·L-1的APS 2 mL，其余組加入等體積的BMSCs專用培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，并用2 Gy的X射線進(jìn)行輻射，輻射后棄去剩余的培養(yǎng)基，加入含1 mmol·L-1β-巰基乙醇的無血清培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入1 mL 4%的中性多聚甲醛固定20 min，棄去多聚甲醛，用雙蒸水沖洗2次，加入甲苯胺藍(lán)染色2 mL，放入37℃孵育30 min，棄去甲苯胺藍(lán)用流水沖洗2次，放入顯微鏡下觀察并拍照。使用Image Pro6.0軟件對陽性表達(dá)尼氏體的密度進(jìn)行分析，每組選取4張圖片，計算每組尼氏體的平均密度，平均密度越大，說明尼氏體的表達(dá)量越多。

1.4.4 Western blot 檢測神經(jīng)相關(guān)蛋白NSE和Nestin的表達(dá) 收集各組細(xì)胞后提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，并用RIPA調(diào)整蛋白濃度。各組取50 μg蛋白上樣， 并經(jīng)5%、12%的凝膠電泳分離， 轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，放在4 ℃冷庫分別與相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000)相結(jié)合， 搖床過夜;次日分別與山羊抗兔和山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記的二抗(1 ∶4 000)結(jié)合反應(yīng)，ECL發(fā)光顯色后，X曝光機(jī)進(jìn)行顯影，并用掃描儀掃描相應(yīng)的條帶， 采用Image J軟件對圖像進(jìn)行光灰度分析，以GAPDH作內(nèi)參，計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芪多糖對輻射后BMSCs細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比較，輻射后各組BMSCs增殖明顯降低(P<0.05),與輻射組相比較，12.5 mg·L-1的黃芪多糖在輻射后d 4和d 5可以明顯促進(jìn)BMSCs的增殖(P<0.05)；25 mg·L-1的黃芪多糖在輻射后d 3、4和d 5時可以明顯促進(jìn)BMSCs的增殖(P<0.05)；50和100 mg·L-1的黃芪多糖具有明顯的促進(jìn)輻射后BMSCs的增殖(P<0.05)；當(dāng)黃芪多糖在50 mg·L-1，與其它濃度在同一時間點相比細(xì)胞的OD值最大，故選50 mg·L-1黃芪多糖作為最佳藥物濃度，見Tab 1。

2.2 黃芪多糖對輻射后BMSCs成神經(jīng)分化的影響

2.2.1 各組細(xì)胞形態(tài)觀察 加入成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)5h后，倒置顯微鏡下觀察，對照組和單純加藥組中見胞體成纖維樣細(xì)胞的BMSCs中部分細(xì)胞胞體變小、變圓，折光性增加，并伸出了細(xì)長的突觸，呈典型的雙極和多極，部分突觸聯(lián)合成網(wǎng)；輻射后胞體變小、變圓，折光性增強(qiáng)的細(xì)胞變少，分化為神經(jīng)細(xì)胞的突觸也變短，而黃芪多糖干預(yù)組胞體變小、變圓，折光性增強(qiáng)的細(xì)胞變多。見Fig 1。

2.2.2 黃芪多糖對輻射后BMSCs成神經(jīng)細(xì)胞分化數(shù)量的影響 對照組和單純加藥組誘導(dǎo)后可見部分細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，而經(jīng)2 Gy的X射線輻射后，分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(P<0.05)，照射前3 d加入50 mg·L-1黃芪多糖干預(yù)后，分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量增多(P<0.05)。見Fig 3。

Tab 1 Effects of APS on proliferation of BMSCs cells after irradiation(±s，n=5)

*P<0.05vsCTRL；#P<0.05vsIR

Fig 1 Changes of cell morphology in each group(5 h,×50)

Fig 2 Number of cells differentiated into nerve cells in each group(5 h,×200)

Fig 3 Effects of APS on differentiation of BMSCs into neuron cells after X irradiation(n=3)

*P<0.05vsControl;#P<0.05vsIR

2.3 黃芪多糖對輻射后BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞中尼氏體的影響 甲苯胺藍(lán)染色見對照組和單純加藥組細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)中被染成藍(lán)色的尼氏體，而未分化的BMSCs未著色，輻射組的細(xì)胞的胞質(zhì)中被染成藍(lán)色的尼氏體的密度明顯減少，照射前3 d加入50 mg·L-1黃芪多糖干預(yù)后細(xì)胞的胞質(zhì)中被染成藍(lán)色的尼氏體的密度明顯增加。見Fig 4。Fig 5中，與對照組相比，輻射后分化為神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)中尼氏體的密度明顯降低(P<0.05)，而當(dāng)給予黃芪多糖干預(yù)后，分化為神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)中尼氏體的密度明顯增加(P<0.05)。

2.4 Western blot 檢測神經(jīng)相關(guān)特異性標(biāo)志蛋白NSE和Nestin的變化 與對照組相比，輻射后誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白NSE和Nestin的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，黃芪多糖干預(yù)后，誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白NSE和Nestin的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見Fig 6、7。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有分化潛能的多能干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，可以為組織器官的修復(fù)和重建提供良好的細(xì)胞來源[8]。在分化過程中，表型特異的轉(zhuǎn)錄因子激活決定BMSCs的分化方向[9]。當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為懸浮生長的細(xì)胞球時，典型的神經(jīng)球細(xì)胞形態(tài)可不斷分裂增殖，并表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物 Nestin、NSE[10-11]。NSE主要存在于神經(jīng)元以及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)，是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物；而Nestin作為未分化完全狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞的抗原標(biāo)志。研究表明神經(jīng)元受輻射后因受到自由基的攻擊而使 NSE的 表達(dá)量降低，說明了 NSE 是反映神經(jīng)元早期損傷的一個靈敏指標(biāo)[12]。骨髓作為輻射的敏感組織，研究表明，當(dāng)接受到輻射刺激時會抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[13]。周妮娜等[14]研究表明當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受到X射線輻射后，引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖抑制，染色體及DNA的損傷。本實驗中發(fā)現(xiàn)提前給予不同濃度的APS干預(yù)后，可以促進(jìn)X射線輻射損傷后BMSCs的增殖，其中以50 mg·L-1的APS的作用最明顯。輻射損傷后可以降低BMSCs分化的相關(guān)基因[15]，而相關(guān)表型特異基因決定了其分化能力。輻射損傷后，分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，其表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物 Nestin、 NSE蛋白表達(dá)降低，說明輻射可以損傷BMSCs向神經(jīng)分化的潛能。尼氏體是神經(jīng)元的重要結(jié)構(gòu)成分，尼氏體的表達(dá)量可以反映出神經(jīng)元的生長發(fā)育、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及功能狀態(tài)，是神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志性物質(zhì)。輻射損傷后，分化為神經(jīng)細(xì)胞的尼氏體表達(dá)降低，嚴(yán)重影響了BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化及分化為神經(jīng)細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥的有效成分可以促進(jìn)BMSCs分化的相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)、成骨等細(xì)胞的分化[16-17]。本研究中提前給予50 mg·L-1的APS干預(yù)后，可以促進(jìn)輻射損傷后BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的數(shù)量，增加了成神經(jīng)分化后標(biāo)記物Nestin、NSE和尼氏體的表達(dá)量。

綜上所述，電離輻射可以影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，而黃芪多糖可以減輕電離輻射對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響，從而為 BMSCs 移植聯(lián)合黃芪多糖在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了有力的實驗依據(jù)。

Fig 4 Cells differentiated into neurons after staining with Toluidine blue(5 h,×200)

Fig 5 Effect of APS on Nissl body with differentiation of BMSCs into neuronal cells after irradiation(n=4)

*P<0.05vsCTRL;#P<0.05vsIR

Fig 6 Expression of neuron specific marker protein NSE and Nestin in each group

Fig 7 Relative expression of protein

*P<0.05vsCTRL;#P<0.05vsIR

(致謝：本研究在甘肅省空間輻射生物學(xué)重點實驗室和甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室完成)

[1] Liu X, Chen T, Wu Y, et al. Role and mechanism of PTEN in adiponectin-induced osteogenesis in human bone marrow mesenchymal stem cells[J].BiochemBiophysResCommun,2016,12(29): 712-7.

[2] 周晨慧,張 雪,徐道華. 牡荊苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014,31(4):405-8.

[2] Zhou C H, Zhang X, Xu D H.Effect of vitexin on the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J].ChinJModApplPharm,2014,31(4):405-8.

[3] Viganò M, Sansone V,d′Agostino M C,et al.Mesenchymal stem cells as therapeutic target of biophysical stimulation for the treatment of musculoskeletal disorders[J].JOrthopSurgeryRes, 2016, 11(1): 1-8.

[4] Dun C, Liu J, Qiu F, et al. Effects of Astragalus polysaccharides on memory impairment in a diabetic rat model[J].NeuropsychiatrDisTreat, 2016, 12(1):1617-21.

[5] 王金磊, 李承德, 孫宏偉,等.黃芪多糖抑制 NF-κB/MAPK 信號通路和改善哮喘大鼠氣道炎癥的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2016,32(4):489-93.

[5] Wang J L,Li C D,Sun H W,et al. Astragalus polysaccharide regulates NF-κB /MAPK signaling pathway and attenuates airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats[J].ChinPharmacolBull,2016,32(4):489-93.

[6] 李承德, 周文賓, 孫 艷, 等. 黃芪多糖對哮喘大鼠Th17/Treg細(xì)胞因子及肺部炎癥的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報,2013,29(9):1275-8.

[6] Li C D,Zhou W B,Sun Y,et al. Effects of astragalus polysaccharide on Th17/Treg associated cytokines and airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(9):1275-8.

[7] Liu Y, Liu F, Yang Y, et al. Astragalus polysaccharide ameliorates ionizing radiation-induced oxidative stress in mice[J].IntJBiolMacromol, 2014, 68(7):209-14.

[8] Mezey E.The therapeutic potential of bone marrow-derived stromal cells[J].JCellBiochem,2011,112(10):2683-7.

[9] 徐小雅,金慰芳,高建軍,等.體外局部大劑量輻射對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響[J].核技術(shù),2009,10(32):769-73.

[9] Xu X Y,Jin W F,Gao J J, et al.Radiation effect on the differentiation of bone marrow stromal cells of rat[J].NuclTechniq,2009,10(32):769-73.

[10]Ramasamy S,Narayanan G,Sankaran S,et al.Neural stem cell survival factors[J].ArchBiochemBiophys,2013,534(1):71-87.

[11]Zhang G Y,Wang J,Jia Y J,et al.MicroRNA-9 promotes the neuronal differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by activating autophagy[J].NeuralRegenRes,2015,10(2):314-20.

[12]涂 彧,王利利,周菊英,等.電離輻射對大鼠腦組織中稀醇化酶、S-100蛋白表達(dá)的影響[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報,2007,25(3):185-8.

[12]Tu Y,Wang L L,Zhou J Y, et al.Expression of neuro-specific enolase and S-100 protein in sprague-dawle rat brain tissue irradiated by 6MeV electron beam[J].JRadiatResRadiatProcess, 2007,25(3):185-8.

[13]徐小雅,金慰芳,高建軍,等. 輻射對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].輻射研究與輻射工藝報,2009,27(2):111-4.

[13]Xu X Y,Jin W F,Gao J J, et al.Radiation effect on the generation and expression of bone marrow stromal cells[J].JRadiatResRadiatProcess,2009,27(2):111-4.

[14]周妮娜,張利英,劉永琦,等. 黃芪多糖對電離輻射誘發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞基因DNA損傷的保護(hù)作用[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2016,33(2):139-43.

[14]Zhou N N,Zhang L Y,Liu Y Q,et al.Radioprotection of astragalus polysaccharide against genomic DNA damage of mesenchymal stem cell induced by ionizing radiation[J].ChinJModApplPharm,2016,33(2):139-43.

[15]徐小雅,金慰芳,高建軍,等. 輻射對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報,2009,27(2):111-4.

[15]Xu X Y,Jin W F,Gao J J,et al.Radiation effect on the generation and expression of bone marrow stromal cells[J].RadiatResRadiatProcess,2009,27(2):111-4.

[16]劉永琦,李靜雅,蔡 玲,等.黃芪多糖誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的特性[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(6):60-4.

[16]Liu Y Q,Li J Y,Cai L,et al.Induction of astragalus polysaccharides on differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J].ChinJInformTCM, 2014,21(6):60-4.

[17]明磊國,葛寶豐,陳克明,等.蛇床子素對體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨性分化的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2010, 26(8):1098-103.

[17]Ming L G,Ge B F,Chen K M,et al.Effects of osthol on bone marrow stromal stem cell differentiation and proliferationinvitro[J].ChinPharmacolBull,2010, 26(8):1098-103.

Effects of Astragalus polysaccharide on neuronal differentiation potential of mesenchymal stem cell induced by ionizing radiation

LU Zhi-wei1,WANG Lei1,ZHANG Li-ying1,HE Jin-peng3,DING Nan3,REN Chun-zhen1,LI Ling1,WANG Feng-mei1,LIU Yong-qi1,2
(1.Provincial-LevelKeyLaboratoryforMolecμlarMedicineofMajorDiseasesandthePreventionandTreatmentwithTraditionalChineseMedicineResearchinGansuCollegesandUniversities,BasicMedicalCollegeofGansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2.KeyLaboratoryofDunhuangMedicineandTransformationatProvincialandMinisterialLevel,Lanzhou730000,China;3.GansuKeyLaboratoryofSpaceRadiobiology,InstituteofModernPhysics,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou730000,China)

Aim To investigate the effect of Astragalus polysaccharide(APS) on the differentiation ability of human bone marrow mesenchymal stem cells(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs) into nerve cells after irradiated by X rays.Methods We used different concentrations of APS to treat BMSCs which were exposed in 2 GyX ray radiation,then we selected the proliferation ability of BMSCs by CCK-8 method.We also counted the nerve cells that were differentiated from BMSCs.Then we detected the expression of Nissl bodies by Toluidine blue staining,and we also tested the expression of Nestin and NSE by Western blot.Results Compared with the control group,the ability of cell proliferation significantly decreased after X ray radiation(P<0.05),compared with radiation group,the proliferation ability of BMSCs treated by APS significantly increased(P<0.05). Moreover, BMSCs had the best proliferation ability which was treated by APS in the concentration of 50 mg·L-1.Then we chose this dose as the best drug concentration. The number of nerve cells significantly decreased after radiation(P<0.05). Neural cells significantly increased(P<0.05) after treated by APS. We found the expression of Nissl bodies decreased after radiation(P<0.05),and increased significantly(P<0.05) after treated by APS. The expression of Nestin and NSE decreased after radiation(P<0.05), and their expression level increased after treated by APS(P<0.05).Conclusion APS has protective effects on the differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells exposed in ionizing radiation.

Astragalus polysaccharide;ionizing radiation; bone marrow mesenchymal stem cells; neuronal differentiation potential; Nissl body; protective effect

2017-03-18,

2017-05-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81473457)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年項目(No ZQ2014-11)

盧志偉(1987-)，男，碩士生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤，E-mail：476026313@qq.com； 劉永琦(1973-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：干細(xì)胞生物學(xué)，通訊作者，E-mail：liuyongqi73@163.com

時間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.026.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.013

A

1001-1978(2017)07-0950-06

R284.1；R329.24；R322.8；R394.2；R818