郭勇英， 常麗萍，張軍芳，高懷林

(1.河北省中醫(yī)院醫(yī)務(wù)處, 河北 石家莊 050011;2. 河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.河北以嶺醫(yī)藥研究院,河北 石家莊 050035;4.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 石家莊 050091)

◇研究簡報(bào)◇

通心絡(luò)對(duì)糖尿病足大鼠缺血下肢移植外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的微環(huán)境影響

郭勇英1， 常麗萍2，張軍芳3，高懷林4

(1.河北省中醫(yī)院醫(yī)務(wù)處, 河北 石家莊 050011;2. 河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.河北以嶺醫(yī)藥研究院,河北 石家莊 050035;4.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 石家莊 050091)

外周血間充質(zhì)干細(xì)胞；通心絡(luò)；糖尿病足大鼠模型；血管新生；炎癥；微環(huán)境

研究發(fā)現(xiàn)[1]，通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植可通過調(diào)節(jié)HIF-1/VEGF通路及miR-210表達(dá)來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成。然而，局部惡劣的微環(huán)境，如缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，不利于心肌梗死區(qū)干細(xì)胞移植后的生存、分化，致使其療效受限[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究就通心絡(luò)是否改善糖尿病足(dibetic foot, DF)大鼠缺血下肢外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植炎癥水平，以探討其促進(jìn)外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療血管新生效果的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 通心絡(luò)原粉、鏈脲佐菌素(STZ)、4、6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚來源及批號(hào)參照文獻(xiàn)[1,3]，IL-1、IL-6、TNF-α檢測試劑盒(南京建成，批號(hào)20140526),ICAM-1 Mouse monoclonal antibody(ab171123, 英國Abcam公司)，VCAM-1 Rabbit monoclonal antibody(ab134047,英國Abcam公司)。

1.2 儀器 CTR6000熒光顯微鏡(德國Leica公司)，170-930型電轉(zhuǎn)膜儀、165-8001型垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 SD大鼠，50只，體質(zhì)量190～230 g[由中國食品藥品檢定研究院提供，合格證號(hào)SCX K(京)2009-0017]，參照文獻(xiàn)[1]的造模方法，造模大鼠高脂[3]喂養(yǎng)8周，禁食16 h后腹腔注射STZ(35 mg·kg-1)，72 h后測尾尖血糖在16.7 mmol·L-1以上者入選為糖尿病模型。入模大鼠結(jié)扎并剪斷股動(dòng)脈和股靜脈建立糖尿病足模型，并隨機(jī)分為模型組(MD)、通心絡(luò)組(TXL)、外周血間充質(zhì)干細(xì)胞組(PB-MSCs)、通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞組(T-MSCs)，每組10只，以同批次正常大鼠復(fù)制下肢缺血模型為對(duì)照組(CN)、DM和PB-MSCs大鼠以等體積的生理鹽水灌胃，TXL和T-MSCs給予通心絡(luò)0.4 g·kg-1·d-1，灌胃4周；PB-MSCs和T-MSCs術(shù)后3 d肌肉注射給予干細(xì)胞移植1.0×109·L-1，CN、MD和TXL同點(diǎn)肌肉注射等體積無菌RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.4 檢測干細(xì)胞在體內(nèi)存活 肌肉組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus 5.0(IPP)圖像處理分析軟件方法分析。

1.5 各組大鼠血清炎性因子水平檢測 放射免疫分析技術(shù)檢測IL-1、IL-6和TNF-α。

1.6 肌肉血管內(nèi)皮因子相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]檢測大鼠缺血下肢肌組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞移植后計(jì)數(shù)和積分光密度 T-MSCs干細(xì)胞數(shù)和積分光密度多于PB-MSCs(P<0.01)，Tab 1。

2.2 各組大鼠血清炎性因子和血管內(nèi)皮因子表達(dá)變化 與CN比較，MD中IL-1、IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。與MD比較，PB-MSCs中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；余用藥組中表達(dá)均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與PB-MSCs比較，T-MSCs血清IL-1、IL-6和TNF-α明顯降低(P<0.01)。見Tab 2～3。

Tab 1 Comparison of number,B and IOD of rats in different groups at 28 d(±s)

**P<0.01vsPB-MSCs group

Tab 2 Comparison of IL-1,IL-6 and TNF-α of serum rats in different groups(±s,n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsPB-MSCs group

Tab 3 Protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in different groups by Western blot(±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 討論

近年來隨著國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制，在糖尿病足(dibetic foot, DF)的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用[4]。既往研究[5]發(fā)現(xiàn)，組織缺血缺氧、缺血/再灌注損傷時(shí)，引發(fā)大量炎性因子釋放強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)等，導(dǎo)致缺血缺氧組織區(qū)域微環(huán)境惡劣，導(dǎo)致移植后的干細(xì)胞大量死亡，致使其療效受限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明通絡(luò)藥物可以減輕炎癥刺激，提高干細(xì)胞移植后血管新生。因此推測中藥通心絡(luò)可能通過改善干細(xì)胞移植的局部微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞移植后治療性血管新生及側(cè)支循環(huán)建立，改善缺血下肢血流灌注量，改善缺血血供。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)由河北以嶺醫(yī)藥研究院、國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室指導(dǎo)，于河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝以上科室對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供的技術(shù)指導(dǎo)及資金支持。)

[1] 郭勇英,張軍芳,賈存勤,等.通心絡(luò)超微粉聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病足大鼠血管新生HIF-1/VEGF通路及miR-210表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31(12):1749-54.

[1] Guo Y Y, Zhang J F, Jia C Q, et al. Treatment effect of Tongxinluo combined peripheral blood derived mesenchymal stem cells transplantation on angiogenesis of HIF-1/VEGF pathway and miR-210 in diabetic foot rat[J].ChinPharmacolBull,2015,31(12):1749-54.

[2] Wu J, Li J, Zhang N, Zhang C. Stem cell-based therapies in ischemic heart diseases: a focus on aspects of microcirculation and inflammation[J].BasicResCardiol, 2011, 106(3): 317-24.

[3] 孫 穎, 郭勇英, 李紅蓉, 等. 通心絡(luò)對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠糖脂代謝的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31(8):1181-2.

[3] Sun Y,Guo Y Y, Li H R, et al. Effect of Tongxinluo on glucose metabolism in rat fed with high-fat diet[J].ChinPharmacolBull,2015,31(8):1181-2.

[4] 張東萍,曹建春,奚九一.陳蘭花沖劑對(duì)糖尿病足大鼠血清TNF-α,IL-6, CRP的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(8):114-8.

[4] Cao D P, Cao J C, Xi J Y. Effect of Chenlanhua Chongji on serum TNF-α, IL-6, CRP of diabetic foot rat[J].JMedRes, 2011, 40(8):114-8.

[5] Wu J, Li J, Zhang N, Zhang C. Stem cell-based therapies in ischemic heart diseases: a focus on aspects of microcirculation and inflammation[J].BasicResCardiol, 2011, 106(3): 317-24.

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Effect of Tongxinluo on microenvironment of peripheral blood derived mesenchymal stem cells transplantation in diabetic foot rat

GUO Yong-ying1, CHANG Li-ping2, ZHANG Jun-fang3, GAO Huai-lin4

(1.MedicalDepartmengtofTraditionalChineseMedicineHospitalofHebeiProvince,Shijiangzhuang050011,China; 2.HebeiKeyLabforCollateralDisease,Shijiazhuang050035,China; 3.HebeiYilingMedicineResearchInstitute,Shijiazhuang050035,China; 4.EndocrinologyofYilingHospitalAffiliatedofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050091,China)

peripheral blood derived mesenchymal stem cells；Tongxinluo；diabetic foot rat model；angiogenesis；inflammation; microenvironment

2017-03-28,

2017-05-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863 計(jì)劃)項(xiàng)目(No 2011AA020115)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973 計(jì)劃)項(xiàng)目(No 2012CB518606)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(No 2014082)

郭勇英(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：糖尿病及絡(luò)病，E-mail: tangyaohaohe@sohu.com; 高懷林(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病及絡(luò)病的臨床與科研，通訊作者，E-mail: gaohuailin@126.com

時(shí)間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.028

A

1001-1978(2017)07-1032-02

R-332；R287；R323.72；R364.12；R364.5；R587.2；R617