周 波,錢(qián) 坤,胡明珠,季 永

(1.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221004;2. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院無(wú)錫市第四人民醫(yī)院麻醉科,江蘇 無(wú)錫 214062)

PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路介導(dǎo)硫化氫后處理對(duì)缺氧H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

周 波1,2,錢(qián) 坤2,胡明珠2,季 永1,2

(1.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 徐州 221004;2. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院無(wú)錫市第四人民醫(yī)院麻醉科,江蘇 無(wú)錫 214062)

目的 探討硫氫化鈉(NaHS)后處理是否通過(guò)PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡發(fā)揮減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的作用。方法 H9c2大鼠心肌細(xì)胞缺氧3 h/復(fù)氧6 h，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白組(Control組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)、硫氫化鈉后處理組(H/R+NaHS組)、抑制劑LY294002組(H/R+LY組)、硫氫化鈉后處理+LY294002組(H/R+NaHS+LY組)。分別在缺氧前、復(fù)氧末檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞的存活率以及LDH釋放；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim蛋白的表達(dá)水平；免疫熒光檢測(cè)FoxO3a的分布情況。結(jié)果 缺氧前各組心肌細(xì)胞存活率、LDH釋放量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)氧末，NaHS組與H/R組相比，心肌細(xì)胞存活率明顯提高(P<0.05)，LDH釋放量與細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；p-Akt、p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平升高，Bim表達(dá)降低，同時(shí)FoxO3a在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)升高。LY294002 逆轉(zhuǎn)了NaHS后處理產(chǎn)生的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，使得H/R+NaHS+LY組的心肌細(xì)胞存活率降低(P<0.05)、LDH釋放和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，p-Akt、p-FoxO3a蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bim表達(dá)升高(P<0.05)，F(xiàn)oxO3a在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)水平降低。結(jié)論 硫氫化鈉(NaHS)后處理通過(guò)PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷。

缺氧/復(fù)氧損傷；硫化氫；心肌保護(hù)；PI3K/Akt；FoxO3a；Bim；后處理

近年來(lái)許多研究表明，硫化氫(hydrogen sufide,H2S)是一種能夠在心血管系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用的氣體信號(hào)分子[1-2]。本課題組前期研究表明，H2S后處理通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidyqinositol-3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)減輕大鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷[3-4],但其下游的具體機(jī)制尚未明確。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子O3a(FoxO3a)參與缺血/再灌注損傷心肌的損傷過(guò)程，激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以使得FoxO3a發(fā)生磷酸化并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)從而發(fā)揮減輕心肌細(xì)胞的凋亡作用，同時(shí)FoxO3a的下游靶分子凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim表達(dá)降低。然而，PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路是否參與外源性的H2S保護(hù)心肌細(xì)胞的I/R損傷過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)H9c2大鼠心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷模型和PI3K/Akt 特異性抑制劑 LY294002來(lái)觀察PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路在H2S后處理保護(hù)心肌H/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9c2大鼠心肌細(xì)胞(中喬新舟公司, 上海)；胎牛血清(依科賽生物，上海)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone,美國(guó))；硫氫化鈉、LY294002(Sigma,美國(guó))；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(康為世紀(jì)，北京)；p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim兔單克隆抗體(CST，美國(guó))；Akt兔多克隆抗體(萬(wàn)類(lèi)生物，沈陽(yáng))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(微科曼得生物工程有限公司)；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本 Olympus公司)； 流式細(xì)胞儀 (美國(guó) Becton Dickinso 公司)。

1.3 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、95%空氣和5% CO2培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到85～90%時(shí)傳代。

1.4 H9c2細(xì)胞H/R模型建立 參照文獻(xiàn)[6],用95% N2和5% CO2飽和30 min的缺氧液(in mmol·L-1:5.37 KCl，0.44 KH2PO4，136.89 NaCl，4.166 NaHCO3，0.338 Na2HPO4，用乳酸調(diào)節(jié)pH為6.8)置換正常培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞置于含95% N2和5% CO2的密閉容器中，一同放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，即為缺氧；然后用95% O2和5% CO2飽和30 min的復(fù)氧液(in mmol·L-1:5.0 KCl,0.9 NaH2PO4, 20.0 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 1.2 MgSO4, 5.5葡萄糖, 20 HEPES, 129.5 NaCl, pH 7.4)置換缺氧液，置于95%空氣、5% CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h，即為復(fù)氧。

1.5 分組與方法 將培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為5組：① Control組, 將心肌細(xì)胞用復(fù)氧液培養(yǎng)9 h；② H/R組：細(xì)胞缺氧3 h后，用復(fù)氧液培養(yǎng)6 h；③ H/R+NaHS組：在復(fù)氧初給予100 μmol·L-1NaHS[6]處理30 min，然后用復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)5.5 h；④ H/R+NaHS+LY組：在復(fù)氧前40 min給予20 μmol·L-1LY294002處理40 min，其余處理同H/R+NaHS組；⑤ H/R+LY組在復(fù)氧前40 min給予20 μmol·L-1LY294002處理40 min，其余處理同H/R組。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將H9c2心肌細(xì)胞以6×103密度接種于96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后隨機(jī)分組并按照上述方法處理后，于每孔加入10% CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標(biāo)儀(γ=450 nm)測(cè)定各孔吸光度OD值，細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.7 培養(yǎng)基中LDH釋放檢測(cè) 分別取缺氧前和復(fù)氧末培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)液中的LDH水平。

1.8 流式細(xì)胞術(shù) 用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，各組細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方法處理后，收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗滌兩次并離心后棄上清，用250 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×109·L-1，取100 μL加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 充分混勻，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL PBS,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim蛋白的表達(dá)水平 將各組處理好的細(xì)胞用胰酶消化后，用PBS洗3遍，加入裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心15 min后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液煮沸10 min。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(Akt,1 ∶1 000;p-Akt,1 ∶1 000;FoxO3a,1 ∶800; p-FoxO3a,1 ∶1 000;Bim,1 ∶1 000；GAPDH,1 ∶8 000)，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000),室溫?fù)u床2 h，采用ECL發(fā)光液曝光顯色，用Image J對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.10 免疫熒光檢測(cè)FoxO3a的表達(dá) H9c2細(xì)胞于24孔板上細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，生長(zhǎng)良好進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的處理。用PBS洗3次，在15%的多聚甲醛中固定15 min后，0.5% TritonX-100(PBS配制)室溫通透20 min，吸水紙吸干，10%山羊血清封閉30 min。加一抗：FoxO3a(1 ∶200)于4℃過(guò)夜；加熒光二抗(1 ∶200)室溫避光孵育1 h；DAPI染核10 min，封片劑封片。熒光顯微鏡觀察并采集圖像，Image J軟件對(duì)熒光結(jié)果進(jìn)行分析。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 硫氫化鈉后處理能夠減輕H9c2缺氧/復(fù)氧損傷 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在復(fù)氧末，與H/R組比較，100 μmol·L-1的NaHS能夠減輕H/R造成的損傷，明顯增加細(xì)胞的存活率，LDH的釋放量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NaHS后處理組相比，NaHS+LY組明顯降低了細(xì)胞的存活率、增加了LDH的釋放(P<0.05)。見(jiàn)Fig 1A、1B。

Fig 1 NaHS postconditioning inhibits the cytotoxicity by hypoxia/ reoxygenation(±s，n=5)

A: Cell viability of H9c2 cardiomyocytes; B: Release of LDH.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;△P<0.05vsH/R+NaHS

3.2 硫氫化鈉后處理減輕H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡情況，如Fig 2A、2B所示，和正常組(9.68±0.93)%相比，H/R組(20.50±2.48)%的凋亡率明顯增加(P<0.05)；而與H/R組相比，NaHS后處理組(13.80±1.73)%凋亡率明顯增加(P<0.05)，說(shuō)明NaHS后處理減輕了H/R引起的細(xì)胞凋亡。與NaHS后處理組相比，NaHS+LY組的凋亡率(19.24±1.51)明顯增加(P<0.05)。

3.3 硫氫化鈉后處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot 法分析結(jié)果見(jiàn)Fig 3A、3B和3C。H/R組與Control組相比，p-Akt、p- FoxO3a表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),Bim表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，NaHS后處理組的p-Akt、p- FoxO3a表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),Bim表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而LY294002抑制了NaHS對(duì)Akt與FoxO3a的磷酸化作用(P<0.05)。

Fig 2 Effects of NaHS postconditioning on

A and B:Apoptosis rate detected by Annexin V/PI flow cytometry.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;△P<0.05vsH/R+NaHS

3.4 硫氫化鈉后處理對(duì)H9c2細(xì)胞FoxO3a的細(xì)胞分布影響 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)FoxO3a的細(xì)胞分布，結(jié)果見(jiàn)Fig 4A、4B。與Control組相比，H/R組的FoxO3a在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)減少(P<0.05)；NaHS后處理組細(xì)胞質(zhì)FoxO3a也較H/R組明顯升高(P<0.05)；而NaHS+LY組的細(xì)胞質(zhì)FoxO3a較NaHS后處理組明顯降低(P<0.05)。

4 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)，H2S在心血管系統(tǒng)的生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，本課題組前期的研究也表明,H2S后處理可以減輕大鼠心臟I/R損傷，對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用。

1:Control; 2:H/R;3:H/R+NaHS; 4:HR+NaHS+LY;5:H/R+LY; A,B and C：Protein levels of Akt,p-Akt,FoxO3a,p- FoxO3a and Bim tested by Western blot.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;△P<0.05vsH/R+NaHS

FoxO3a(forkhead box O3a，叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的FoxO家族中的亞族，參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程,包括調(diào)節(jié)凋亡、氧化應(yīng)激、能量代謝等[7-8]。FoxO3a發(fā)生磷酸化可以抑制FoxO3a的活性和對(duì)靶基因的調(diào)控[5]。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞族的成員，是一種重要的促凋亡蛋白，很多研究證實(shí)，Bim是FoxO3a的下游基因，F(xiàn)oxO3a可以結(jié)合在Bim的啟動(dòng)子上促進(jìn)Bim蛋白的表達(dá)，從而啟動(dòng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡過(guò)程[12]。但是FoxO3a的磷酸化以及Bim是否參與H2S的抗心肌缺血作用還尚未知。本研究發(fā)現(xiàn)，p-FoxO3a在H/R組較Control組降低，而在NaHS后處理組升高，同時(shí)Bim表達(dá)以及細(xì)胞凋亡減少，認(rèn)為FoxO3a的磷酸化在NaHS后處理保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷中起重要作用。

本課題組前期研究表明PI3K/Akt通路參與H2S后處理保護(hù)大鼠缺血心肌細(xì)胞，可能與調(diào)節(jié)Sirt1的表達(dá)[9]以及調(diào)節(jié)Cx43蛋白的表達(dá)[10]有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，F(xiàn)oxO3a是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，激活PI3K/Akt可以磷酸化FoxO3a。為了研究PI3K/Akt/FoxO3a通路在H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用，本研究通過(guò)應(yīng)用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002，觀察各組細(xì)胞的存活率、凋亡率、LDH釋放量、相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以及在FoxO3a在細(xì)胞中的分布情況。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H9c2大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧3 h，復(fù)氧6 h處理后,與H/R組相比較, H/R+NaHS組細(xì)胞存活率升高，LDH釋放量和細(xì)胞凋亡率降低，同時(shí)p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)增加，Bim表達(dá)降低。而在加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，H2S后處理減輕H9c2細(xì)胞的H/R損傷的作用被逆轉(zhuǎn)，p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡及Bim表達(dá)增加。提示PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信號(hào)通路參與了H2S后處理對(duì)心肌 H/R損傷的保護(hù)作用。

A:FoxO3a and DAPI-stained nuclei were visualized by fluorescence microscopy. The representative pictures of each group are shown(400×);B:The percentage of cytoplasmic and nuclei FoxO3a for each group was quantified.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;△P<0.05vsH/R+NaHS

FoxO3a在正常情況下在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，F(xiàn)oxO3a的表達(dá)受到多種翻譯后加工的作用[13]，其中磷酸化作用是最重要的一種， FoxO3a的磷酸化可以使FoxO3a從細(xì)胞核移出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[14]。實(shí)驗(yàn)采用了免疫熒光方法對(duì)FoxO3a的定位進(jìn)行研究，結(jié)果可以看出，Control組中FoxO3a在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，H/R處理后，細(xì)胞質(zhì)中的FoxO3a比例明顯減少。而與H/R組相比，NaHS的后處理使得細(xì)胞質(zhì)中FoxO3a的比例明顯升高，提示NaHS可以使FoxO3a從細(xì)胞核移出，保護(hù)心肌細(xì)胞。但FoxO3a發(fā)揮作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明NaHS后處理通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路增加Akt、FoxO3a的磷酸化，增加FoxO3a從細(xì)胞核移出和減少Bim的表達(dá)減輕H9c2大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)研究主要在無(wú)錫市第四人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成,感謝季永教授、黃朝輝研究員給予實(shí)驗(yàn)的悉心指導(dǎo)和幫助!)

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PI3K/Akt/FoxO3a/Bim signaling pathway mediated hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against H/R injury

ZHOU Bo1,2,QIAN Kun2,HU Ming-zhu2,JI Yong1,2
(1.JiangsuKeyLaboratoryofAnesthesiology,JiangsuKeyLaboratoryofAnesthsiaandAnalgesiaApplicationTechnology,XuzhouJiangsu221004,China;2.DeptofAnesthesiology,theAffiliatedHospitalofJiangnanUniversity(Wuxi4thPeople′sHospital),WuxiJiangsu214062,China)

Aim To explore the role of PI3K/Akt/FoxO3a/Bim pathway in H9c2 cardiomyocytes cardioprotection of hydrogen sulfide(H2S) postconditioning against hypoxia/reoxygenation(H/R) injury.Methods H9c2 cells were subjected to 3h hypoxia followed by 6h reoxygenation. Cells were divided into 5 groups: control group(Control),hypoxia/Reoxygenation group(H/R), NaHS postconditioning group(H/R+NaHS), NaHS with inhibitor LY294002 group(H/R+NaHS+LY) and LY294002 group(H/R+LY). The survival percentage of H9c2 cells and the release of LDH were detected at pre-hypoxia and reoxygenation 6 h.The flow cytometry was used to determine cell apoptosis at the end of reoxygenation. The expressions of Akt,p-Akt，F(xiàn)oxO3a，p-FoxO3a，Bim were detected by Western blot. Immunofluorescence staining was used to determine the expression of FoxO3a.Results There were no differences between each group before hypoxia(P>0.05). At the end of reoxygenation, cell viability in H/R+NaHS group was significantly improved (P<0.05),and the release of LDH and cell apoptosis rates were significantly decreased(P<0.05). Meanwhile, the expression of p-Akt,p-FoxO3a and cytoplasm FoxO3a was significantly improved, and Bim was significantly decreased. But LY294002 abolished the myocardial protection effects of NaHS, and significantly decreased p-Akt,p-FoxO3a and cytoplasm FoxO3a level, and increased Bim level.Conclusion PI3K/Akt/FoxO3a/Bim signaling pathway mediates hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against H/R injury.

hypoxia/reoxygenation injury； hydrogen sulfide；myocardial protection；PI3K/ Akt；FoxO3a；Bim ；postconditioning

2017-02-15,

2017-05-06

無(wú)錫市醫(yī)院管理中心醫(yī)學(xué)科研面上項(xiàng)目(No YGZXM14017)

周 波(1988-)，男，碩士生，研究方向：重要臟器功能衰竭的機(jī)制及預(yù)防，E-mail:zblxe@163.com; 季 永(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心、肺、腦功能衰竭的機(jī)制及預(yù)防，通訊作者，E-mail:jiyong6941@163.com

時(shí)間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.034.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.017

A

1001-1978(2017)07-0971-06

R-332；R322.11；R329.25；R542.2；R845.22